高效液相色譜-質(zhì)譜法測定畜肉中的卡拉膠

張會亮，黃傳峰，李佩璇，江 豐，孫姍姍，丁 宏，曹 進(jìn),*

（1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.臨沂市食品藥品檢驗檢測中心，山東 臨沂 276000；3.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430073）

卡拉膠是紅藻的細(xì)胞壁多糖，是由半乳糖及半乳糖衍生物構(gòu)成的半乳聚糖硫酸酯。根據(jù)重復(fù)結(jié)構(gòu)特征以及1,3-連接的D-半乳糖上的硫酸基位置，卡拉膠可分為11種不同構(gòu)型，主要構(gòu)型為κ-型、ι-型和λ-型卡拉膠，尤其以κ-型多見[1]。藻體中不存在理想的重復(fù)二糖結(jié)構(gòu)的卡拉膠，均為多種卡拉膠結(jié)構(gòu)的混合體，食品級卡拉膠也可看作各種構(gòu)型卡拉膠的混合物[2]。

“注水肉”是指在生豬、牛、羊屠宰前或屠宰過程中，不法分子以灌胃或向血管泵注等形式，將水摻入動物體內(nèi)得到的生、鮮肉品。畜肉注水是存在已久的行業(yè)亂象，是食品安全聚焦點之一?？ɡz因具有強大的保水性、增稠性，被不法分子所青睞，用于“注水升級”版本的“注膠肉”，各類媒體已多有報道。注入“卡拉膠水”的肉品，水分黏度增大，不易外流，較“注水肉”更加難以識別。制備“注膠肉”不僅屬于欺詐行為，因灌注的膠水中往往摻雜有防腐劑、血、工業(yè)色素等物質(zhì)，改變了肉品組成，引入致病微生物和外來物質(zhì)污染、重金屬超標(biāo)等風(fēng)險，還會危害食品安全[3]。

目前“注膠肉”尚無相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)范，僅可通過相關(guān)水分含量標(biāo)準(zhǔn)判斷。相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的豬肉的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得高于77%[4]，由于識別的有效性欠缺，對違法樣品打擊力度不足[5-6]。國外報道了用聚合物基質(zhì)管狀膜傳感器作為電極，以電位測定方法定量測定卡拉膠含量[7]。目前國內(nèi)研究中采用最多的檢測“注膠肉”的技術(shù)是低場核磁共振（low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技術(shù)和近紅外光譜（near infrared spectroscopy，NIR）技術(shù)?；跇悠稬F-NMR弛豫特性的判別分析可實現(xiàn)對肉糜注膠程度的分段預(yù)測[8]；利用LF-NMR結(jié)合主成分分析法，根據(jù)肉品中的水分存在狀態(tài)及分布結(jié)果，實現(xiàn)對豬肉中的卡拉膠的檢測[9]。NIR方法報道的有結(jié)合主成分分析和判別分析法[10]、結(jié)合偏最小二乘法[11]建立注膠肉和正常肉的定性判別模型；使用一階導(dǎo)數(shù)對光譜進(jìn)行預(yù)處理，采用因子化法建立定性判別模型[12]等。

上述方法均依賴于判別模型、主成分分析等化學(xué)計量學(xué)手段，不易推廣；判定參數(shù)不明確，難以作為定性特別是執(zhí)法檢驗的依據(jù)，限制了其應(yīng)用。本實驗針對卡拉膠主要來源為人為添加，在新鮮肉品中并不存在的特性，提供了一種利用高效液相色譜-質(zhì)譜法對卡拉膠特征性降解產(chǎn)物，即標(biāo)志物進(jìn)行檢測的方法。經(jīng)多家實驗室驗證表明，該方法對畜肉中存在的卡拉膠可實現(xiàn)靈敏、特異性識別，可作為打擊“注膠”畜肉的有效技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不含卡拉膠畜肉來源于養(yǎng)殖廠，并全程跟蹤屠宰過程，其他畜肉樣品采購于超市；卡拉膠（食品添加劑級） 石獅市環(huán)球瓊脂工業(yè)有限公司。甲酸銨（批號LH80P38，優(yōu)級純） 百靈威公司；鹽酸（批號20150930，分析純） 北京化工廠。實驗所用水均為一級水。

1.2 儀器與設(shè)備

1290-6460液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀、1290-6540液相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀 美國安捷倫公司；vortex-5型渦旋混勻器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；AL 204電子天平 瑞士梅特勒公司；INTEGRAL 3純水儀美國Milipore公司；ZWY240恒溫水浴 上海智城公司；Pro 200高速勻漿機 美國Pro公司。

1.3 方法

1.3.1 對照品儲備液

稱取卡拉膠0.1 g，用8 mL 60 ℃溫水溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，冷卻后用水定容，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的儲備液。

1.3.2 樣品處理

待測樣品用食品料理機充分打碎混勻，稱取10 g于50 mL離心管中，加入23 mL水，10 000 r/min勻漿1 min，加入2 mL 12 mol/L鹽酸，加蓋渦旋30 s后置于80 ℃水浴中20 min，每10 min振搖一次。取出放冷至室溫后，4 000 r/min離心5 min，上清液用乙腈1∶1稀釋，過0.22 μm尼龍濾膜，供高效液相色譜-質(zhì)譜檢測。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備

稱取打碎混勻的不含卡拉膠的畜肉10 g于50 mL離心管中，分別加入卡拉膠對照品儲備液0.1、0.2、0.3、0.4 mL，加入水使液體量為23 mL，10 000 r/min勻漿1 min，以下操作同1.3.2節(jié)，供高效液相色譜-質(zhì)譜檢測。

1.3.4 儀器條件

1.3.4.1 液相色譜條件

色譜柱：W a t e r s B E H A m i d e色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：A為10 mmol/L甲酸銨溶液，B為乙腈；流速：300 μL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。梯度洗脫，流動相B相比例為：初始80%，3 min內(nèi)變至40%，保持至5 min結(jié)束。

1.3.4.2 串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負(fù)離子模式掃描；毛細(xì)管電壓4 000 V；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；干燥氣溫度200 ℃，流量5 L/min；鞘氣溫度280 ℃，鞘氣流量8 L/min；霧化氣壓力30 psi。監(jiān)測離子對信息見表1。1.3.5 高分辨質(zhì)譜條件

表1 串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜中的卡拉膠特征離子對Table 1 Triple quadrupole mass spectrometric parameters for carrageenan

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負(fù)離子模式掃描；干燥氣溫度325 ℃；流量10 L/min；霧化氣壓力40 psi；碎裂電壓：135 V；毛細(xì)管電壓4 000 V；檢測方式：一級質(zhì)譜掃描，用于定性的離子信息見表2。

表2 高分辨質(zhì)譜中的卡拉膠特征離子Table 2 Characteristic ions of carrageenan by high resolution mass spectrometry

1.3.6 定性和定量方法

表1中兩對離子均可用于定性和定量。樣品溶液中多反應(yīng)監(jiān)測色譜峰的保留時間、豐度比與標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜峰一致時，可判定檢出卡拉膠成分。使用高分辨質(zhì)譜確認(rèn)時，出現(xiàn)2 種或2 種以上表2中離子時，可確證檢出。

定量測定以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中含卡拉膠的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以表1中定量離子的色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。按外標(biāo)法計算待測樣品中卡拉膠的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)志物離子的確定方法

卡拉膠的降解方式有酶法、酸法和物理方法[13-16]。不同降解方式可得到不同系列的卡拉膠寡糖[16-18]。使用酸法降解得到的m/z500左右的低分子質(zhì)量端寡糖的種類多于酶法和物理方法[18]，因此本實驗優(yōu)先使用酸法降解。

圖1 卡拉膠標(biāo)志物的確定過程Fig. 1 Flow chart for determination of carrageenan markers

實驗條件下對卡拉膠溶液降解，使用1.3.5節(jié)中的條件進(jìn)行高分辨一級質(zhì)譜采集，得到一系列與文獻(xiàn)報道一致的產(chǎn)物離子[2,13-19]。為了從中篩選可用的標(biāo)志物，取陰性畜肉3 份作為本底組，卡拉膠溶液3 份作為對照組，進(jìn)行了平行處理，采集高分辨一級質(zhì)譜。數(shù)據(jù)經(jīng)過分子特征提取，使用Mass Profiler Professional軟件進(jìn)行差異組分查找，確定可能的標(biāo)志物。增加血液、臟器作為本底進(jìn)一步驗證，排除本底中存在的離子，最終得到了表2中的特異性標(biāo)志物，流程見圖1所示。

圖2展示了Mass Profiler Professional軟件描繪的本底組和對照組中化合物分布示意圖。圖中每條折線均代表一種化合物，縱坐標(biāo)代表化合物含量水平，橫坐標(biāo)代表樣品標(biāo)簽：標(biāo)簽2、3、4為卡拉膠溶液樣品，標(biāo)簽7、8、9為陰性畜肉樣品?？ɡz標(biāo)志物的含量應(yīng)滿足在2、3、4中較高，在7、8、9中較低，如圖2橢圓圈示的折線。

圖2 差異組分分析結(jié)果Fig. 2 Re sults of differential component analysis

在串聯(lián)四極桿質(zhì)譜方法中，最終使用豐度較大的單電荷離子：κ-卡拉膠基本結(jié)構(gòu)單元[G4S-A]和ι-卡拉膠基本結(jié)構(gòu)單元[G4S-A2S]作為特征離子，見圖3。

圖3 用于檢測的卡拉膠標(biāo)志物離子信息Fig. 3 Information about carrageenan ions used as markers

2.2 前處理條件的優(yōu)化

卡拉膠溶液在0.1 mol/L稀酸存在的條件下即可發(fā)生降解生成寡糖[20]。但卡拉膠與蛋白質(zhì)共存時可形成牢固的交聯(lián)體系，使用卡拉膠酶或稀酸降解體系中的卡拉膠很難得到降解產(chǎn)物[21-22]；在強酸和高溫條件下，體系中的蛋白質(zhì)先被破壞，隨后發(fā)生卡拉膠的降解[23]。此外，酶法降解卡拉膠對試劑和成本要求都較高，而使用超聲物理降解法所需時間過長，酸法降解是最簡便的方法。

考察體系中不同濃度鹽酸對降解效率的影響，見圖4。對于卡拉膠的水溶液，體系中鹽酸濃度為0.1 mol/L時，80 ℃水浴20 min即可得到標(biāo)志物離子；但當(dāng)卡拉膠與肉共存時，體系中0.1 mol/L鹽酸不能使卡拉膠降解；0.5 mol/L鹽酸僅可得到少量降解產(chǎn)物；當(dāng)體系中酸濃度增大至1 mol/L時，可以獲得降解產(chǎn)物，當(dāng)酸濃度增至2 mol/L時，降解產(chǎn)物濃度沒有明顯提高，最終選擇體系中存在1 mol/L鹽酸進(jìn)行降解，見圖4。

圖4 鹽酸濃度對降解效率的影響Fig. 4 Effect of HCl concentration on degradation efficiency

卡拉膠的熱降解遵循偽一級動力學(xué)，延長反應(yīng)時間有助于得到更多產(chǎn)物[24]，但本實驗使用的降解條件較強，延長降解時間對降解產(chǎn)物豐度改善不明顯，見圖5。最終，本實驗使用1 mol/L濃度鹽酸和80 ℃條件下20 min完成了卡拉膠的降解。

圖5 反應(yīng)時間對降解效率的影響Fig. 5 Effect of reaction time on degradation efficiency

2.3 色譜-質(zhì)譜條件與峰形

降解得到的卡拉膠寡糖標(biāo)志物具有較強極性，在C18色譜柱上保留較弱。一些卡拉膠寡糖的表征研究中使用庚胺等離子對試劑-反相色譜[25-26]或凝膠排阻色譜[15,27]，以達(dá)到多種寡糖之間的分離，在此基礎(chǔ)上研究降解產(chǎn)物分布，并進(jìn)行以一級質(zhì)譜為主的定性分析[15,19,28]。本實驗?zāi)康牟辉谟诜蛛x不同寡糖，因此未引入庚胺等離子對試劑，而是使用親水保留色譜達(dá)到分離。

在[A]、[G4S]、[A2S]等六元環(huán)中，m/z 403為母離子的多反應(yīng)監(jiān)測峰形較m/z 483差，這可能是因為[A]環(huán)的空間位阻小、六元環(huán)構(gòu)象差異導(dǎo)致[10,29]。實驗考察水-乙腈和10 mol/L甲酸銨溶液-乙腈體系對分離效果的影響。含甲酸銨的流動相體系中，目標(biāo)化合物峰形得到一定程度改善。由于使用反-反相分離模式，進(jìn)樣前用乙腈對處理得到的溶液進(jìn)行稀釋，以減少溶劑效應(yīng)。

2.4 方法學(xué)考察

分別使用牛肉、羊肉、豬肉3類畜肉，描繪基質(zhì)加標(biāo)工作曲線，并在0.1、0.2 g/kg和0.4 g/kg三水平分別進(jìn)行加標(biāo)，其中0.2 g/kg水平重復(fù)測定6 次。計算回收率和方法重復(fù)性精密度。串聯(lián)四極桿質(zhì)譜中的代表性圖譜見圖6。

圖6 使用串聯(lián)四極桿質(zhì)譜采集得到的色譜圖Fig. 6 Representative chromatograms from triple quadrupole mass spectrometry

本實驗在0.1～0.4 g/kg的含量范圍內(nèi)考察方法學(xué)指標(biāo)。原因如下：用于“注膠”的卡拉膠溶液適宜的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.2%～1%之間，質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于1%，溶液易凝固成膠狀而無法進(jìn)行灌注；質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.2%，溶液注入后被體液進(jìn)一步稀釋，起不到保水作用。問題畜肉注入水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般大于5%。0.1 g/kg含量的卡拉膠相當(dāng)于向牲畜體內(nèi)注入了活體質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的0.2%卡拉膠溶液，屬于較低含量水平，以0.1 g/kg作為標(biāo)曲最低點，可滿足實際應(yīng)用中對靈敏度的要求。

表3 串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法的方法學(xué)指標(biāo)Table 3 Methodological parameters of triple quadrupole mass spectrometry

從表3可見，豬、牛、羊肉3 種基質(zhì)各3 個添加水平的加標(biāo)回收率在90%～120%之間。添加量為0.2 g/kg重復(fù)6 份平行測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。兩對離子對的主要差異在于靈敏度和線性系數(shù)。m/z403＞241離子對的線性相關(guān)系數(shù)在0.99以上；m/z483＞403離子對的線性系數(shù)較差，僅能達(dá)到0.95以上。從曲線斜率上看，m/z403＞241離子對的靈敏度要優(yōu)于m/z483＞403離子對。兩對離子的靈敏度和線性差異的原因是其來源不同：產(chǎn)生m/z403母離子的是κ型基本單元[G4S-A]，其在卡拉膠聚合鏈中占比較高；產(chǎn)生m/z483母離子的是ι-卡拉膠基本結(jié)構(gòu)單元[G4S-A2S]，其在卡拉膠聚合鏈中占比較低。同時，降解過程中，ι-卡拉膠硫酸基團(tuán)容易脫去[27,30]，也導(dǎo)致m/z483離子強度降低，影響線性。

2.5 實際樣品分析結(jié)果

對采購于不同正規(guī)超市的豬、牛、羊肉樣品各10 份進(jìn)行檢測，未檢出陽性結(jié)果。同時采購了標(biāo)簽標(biāo)識添加卡拉膠的調(diào)理牛排（生肉）5 批次，均檢出卡拉膠，含量為0.086～0.39 g/kg。此外，檢測一批標(biāo)識含卡拉膠的豬肉火腿腸（熟肉），檢出含量為0.087 g/kg。實際檢測的標(biāo)識含卡拉膠樣品，結(jié)果未出現(xiàn)假陰性。

3 結(jié) 論

本實驗建立生、鮮畜肉中卡拉膠測定的液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜和液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法，可實現(xiàn)摻入卡拉膠的“注膠肉”的定性和定量測定。該法前處理過程簡單，檢測指標(biāo)明確，方法線性范圍、準(zhǔn)確度、精密度及檢出限均滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求，可作為打擊“注膠肉”亂象的有效手段。