QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定牛奶中6 種玉米赤霉烯酮類毒素

2019-06-11 06:07:02謝瑜杰代漢慧胡雪艷范春林呼秀智薛占永

食品科學(xué) 2019年10期

謝瑜杰，陳輝，彭濤,*，代漢慧，胡雪艷，范春林，呼秀智，薛占永,*

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056021；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176）

玉米赤霉烯酮類毒素是二羥基苯甲酸內(nèi)酯類化合物，屬于非甾體類同化激素，具有弱雌激素功能[1]，包括α-玉米赤霉醇（α-zearalanol，α-ZAL）、β-玉米赤霉醇（β-zearalanol，β-ZAL）、α-玉米赤霉烯醇（α-zearalenol，α-ZOL）、β-玉米赤霉烯醇（β-zearalenol，β-ZOL）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZON）和玉米赤霉酮（zearalenone，ZAN）6 種。其中，ZON主要存在于飼料及農(nóng)產(chǎn)品中。有研究表明，家畜食入含有ZON的飼料或農(nóng)產(chǎn)品后，會(huì)在胃腸道內(nèi)通過代謝產(chǎn)生毒性更強(qiáng)的其他5 種玉米赤霉烯酮類毒素[2-3]（代謝途徑詳見圖1）。我國(guó)GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》規(guī)定ZON在農(nóng)產(chǎn)品中的限量標(biāo)準(zhǔn)為60 μg/kg[4]。而赤霉醇（zeranol，ZER）在養(yǎng)殖業(yè)中常用作家畜的促生長(zhǎng)劑，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，提高飼料轉(zhuǎn)化率及酮體瘦肉率[5-6]。當(dāng)消費(fèi)者食入含有ZER的動(dòng)物性產(chǎn)品后會(huì)抑制體內(nèi)外的激素結(jié)合受體，存在致癌風(fēng)險(xiǎn)[7]。為了確保消費(fèi)者健康，多數(shù)國(guó)家將ZER列為禁用藥物，禁止在食用性動(dòng)物上使用[8-9]，我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告也明確要求在所有食用動(dòng)物以及組織中不得檢出ZER[10]。研究發(fā)現(xiàn)，排出動(dòng)物體外的玉米赤霉烯酮類毒素可通過水和食物造成二次污染，人食用后會(huì)抑制促性腺激素結(jié)合受體，對(duì)人體性機(jī)能以及第二性征造成影響，在外部條件誘導(dǎo)下還會(huì)致癌[11-12]。因此，建立快速簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)食品中玉米赤霉烯酮類毒素方法非常重要。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、穩(wěn)定可靠、定性定量準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，且可以提供目標(biāo)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，使其成為檢測(cè)玉米赤霉烯酮類毒素的常用技術(shù)[13-14]。Visconti等[15]使用HPLC-MS/MS測(cè)定谷物中的6 種玉米赤霉烯酮類毒素；李麗萍等[16]利用HPLC-MS/MS檢測(cè)豬肉中的6 種玉米赤霉烯酮類毒素；邵瑞婷等[17]采用HPLC-MS/MS檢測(cè)牛奶中6 種玉米赤霉烯酮類毒素。已報(bào)道的文獻(xiàn)中，在凈化技術(shù)上多使用具有選擇性好、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)的免疫親和柱凈化與固相萃取等手段。與這些傳統(tǒng)的凈化技術(shù)比，QuEChERS（quick easy cheap, effective,rugged and safe）方法具有簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)勢(shì)，在食品安全檢測(cè)方面應(yīng)用越來(lái)越廣泛。其中，Yan Zheng等[18]采用QuEChERS-LC-MS/MS檢測(cè)豬肉中的6 種玉米赤霉烯酮類毒素。但是，目前針對(duì)檢測(cè)牛奶中玉米赤霉烯酮類毒素的QuEChERS-HPLC-MS/MS檢測(cè)方法的報(bào)道還相對(duì)較少。甄振鵬等[19]建立了QuEChERS-HPLC-MS/MS檢測(cè)方法，對(duì)牛奶中6 種玉米赤霉烯酮類毒素進(jìn)行檢測(cè)，使用乙酸乙酯提取，C18、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、無(wú)水硫酸鎂質(zhì)量比1∶1∶1，凈化提取液，方法定量限為0.33～1 μg/kg，回收率在83.2%～111%之間。

牛奶中含有大量人體必需營(yíng)養(yǎng)素，是人獲取營(yíng)養(yǎng)的主要來(lái)源。但是牛奶中也會(huì)存在一些質(zhì)量問題給身體健康帶來(lái)危害，如玉米赤霉烯酮類毒素的存在，使人類的健康面臨著一定的風(fēng)險(xiǎn)。目前，檢測(cè)牛奶中6 種玉米赤霉烯酮類毒素的方法較多，但操作繁瑣、復(fù)雜、靈敏度低。本研究對(duì)QuEChERS-HPLC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)牛奶中6 種玉米赤霉烯酮類毒素方法進(jìn) 行研究?jī)?yōu)化，以1%乙酸-乙腈作為提取液，用PSA、C18、無(wú)水硫酸鎂質(zhì)量比3∶4∶4為吸附劑，5 mmol/L乙酸銨-乙腈為流動(dòng)相，方法定量限為0.25～0.5 μg/kg，回收率在91.8%～114.5%之間，優(yōu)于已有方法且滿足玉米赤霉烯酮類毒素的限量要求[4,20]。因此，使用本方法檢測(cè)牛奶中玉米赤霉烯酮及其代謝產(chǎn)物，方法簡(jiǎn)單快速、靈敏度高，結(jié)果可靠準(zhǔn)確，可以為準(zhǔn)確快速檢測(cè)牛奶中玉米赤霉烯酮類毒素提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶市購(gòu)。

甲醇、乙腈、正己烷（均為色譜純），甲酸、乙酸（質(zhì)譜級(jí)）美國(guó)Fisher公司；乙酸銨（色譜純）比利時(shí)Acros Organics公司；C18（50 μm）天津博納艾杰爾公司；N-丙基乙二胺（PSA，40～60 μm）艾爾杰公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1290高效液相色譜儀和6460三重四極桿質(zhì)譜儀美國(guó)安捷倫公司；TRIO TM-1 N型旋渦混合器上海AS ONE公司；SR-2DS型水平振蕩器日本TATEC公司；3-30 K型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；N-EVAP 112型氮吹儀美國(guó)Organomation Associates公司；Milli-Q超純水儀美國(guó)Millipore公司；KQ-600B型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品（0.010 0±0.000 5）g，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱保存。需要時(shí)各取儲(chǔ)備液0.1 mL置于10 mL棕色容量瓶中，并用甲醇稀釋成10 mg/L的混合中間液，使用前將中間液用甲醇稀釋配制成1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)液。配制好的溶液均避光、4 ℃保存。

1.3.2 樣品預(yù)處理

1.3.2.1 提取

準(zhǔn)確稱2.00 g牛奶樣品置于50 mL離心管中，加入1%乙酸-乙腈10 mL，振蕩10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液于50 mL離心管中。用1%乙酸-乙腈重復(fù)提取1 次，合并上清液。加入乙腈飽和正己烷5 mL，振蕩10 min，12 000 r/min離心10 min，棄上層正己烷，重復(fù)該過程，待凈化。

1.3.2.2 凈化

將上述溶液轉(zhuǎn)移至裝有80 mg C18、60 mg PSA和80 mg無(wú)水硫酸鎂的離心管中，振蕩10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液（約20 mL）于雞心瓶中，40 ℃旋蒸至約2 mL，在40 ℃氮吹至干，以1 mL水-乙腈（3∶1，V/V）定容，過0.22 μm濾膜后，供HPLC-MS/MS分析。

1.3.3 HPLC-MS/MS分析條件

色譜條件：ZORBAX SB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：A為5 mmol/L NH4Ac溶液，B為乙腈溶液；洗脫梯度：0～5 min，25%～70% B，5～6 min，70% B；6～9 min，70%～25% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multi-reaction monitoring，MRM）；負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓4.0 kV；離子源溫度350 ℃；去溶劑氣流：氮?dú)猓?0 L/min；去溶劑溫度325 ℃；錐孔氣流：氮?dú)猓? L/min；碰撞氣壓0.4 MPa。其他參數(shù)見表1。

1.3.4 基質(zhì)匹配外標(biāo)曲線

以陰性牛奶樣品提取液（操作同1.3.2節(jié)）作為溶劑，將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.1、0.5、1、5、10、20、50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以待測(cè)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制外標(biāo)曲線。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

采用Excel和Origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

玉米赤霉烯酮類毒素脂溶性較好，可以很好地保留在 C18色譜柱上[21]，因此本研究選擇在ZORBAX SB-C18柱上分離。由于該類毒素理化性質(zhì)相似且存在兩對(duì)α和β異構(gòu)體，而MS/MS很難區(qū)分兩對(duì)異構(gòu)體[2-24]，所以必須在液相色譜上對(duì)兩對(duì)異構(gòu)體進(jìn)行分離。同時(shí)，動(dòng)物源性食品是一類復(fù)雜基質(zhì)，其中存在許多干擾雜質(zhì)[25-26]，李賢良等[27]研究發(fā)現(xiàn)使用乙酸銨溶液作為流動(dòng)相可以減少基質(zhì)中雜質(zhì)的干擾，提高離子化效率。因此，本研究參考已有的文獻(xiàn)報(bào)道，通過實(shí)驗(yàn)最終選擇乙腈-5 mmol/L乙酸銨作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，使目標(biāo)物在出峰位置無(wú)雜峰干擾并且出峰時(shí)間彼此分開，如圖2所示。

圖2 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中6 種玉米赤霉烯酮類毒素的MRM色譜圖（質(zhì)量濃度10 ng10 ng/mL）mLFig. 2 MRM chromatograms of 6 zeranols in matrix-matched standard solution (10 ng/mL)

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

玉米赤霉烯酮類毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式均帶有羥基，在ESI模式下易丟失氫離子而帶負(fù)電荷[14,22,28]，產(chǎn)生分子離子[M－H]－。玉米赤霉烯酮易產(chǎn)生碎片離子[M－H－CO2]－和[M－H－C8H14O2]－，而其余5 種毒素丟失一分子水和二氧化碳后產(chǎn)生碎片離子[M－H－H2O]－和[M－H－CO2]－。

本研究以[M－H]－為母離子，在MRM模式下進(jìn)行掃描，選擇響應(yīng)最強(qiáng)的碎片為定量離子，次級(jí)強(qiáng)為定性離子，具體條件詳見表1。選擇監(jiān)測(cè)離子與農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告[29]一致。

2.3 提取溶劑的選擇

玉米赤霉烯酮類毒素為脂溶性物質(zhì)，且呈弱酸性，在酸性及中性條件下易溶于有機(jī)溶劑[24]。已報(bào)道的文獻(xiàn)中動(dòng)物源性食品提取該類物質(zhì)主要采用乙腈[5]、乙酸乙酯[19]、無(wú)水乙醚[30]等。通過參考文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)玉米赤霉烯酮類毒素易在酸性條件下提取，因此本研究在10 μg/kg添加量下首先對(duì)乙腈、1%甲酸-乙腈、1%乙酸-乙腈的提取效果進(jìn)行比較。如圖3所示，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1%乙酸-乙腈作為提取液時(shí)回收率較高，且重復(fù)性良好（n=6）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果本實(shí)驗(yàn)又對(duì)乙酸-乙腈中乙酸體積分?jǐn)?shù)及提取過程等進(jìn)行優(yōu)化，選用0.5%、1%、2%和3%乙酸-乙腈作為提取液，樣品經(jīng)提取液重復(fù)提取，合并上清液，用乙腈飽和正己烷重復(fù)脫脂，比較回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如圖3所示。0.5%乙酸-乙腈回收率和重復(fù)性均較差，1%、2%、3%乙酸-乙腈提取，回收率相當(dāng)且均在70%～120%之間，但使用2%和3%乙酸-乙腈時(shí)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較差，因此，選擇1%乙酸-乙腈作為提取劑。在10 μg/kg加標(biāo)水平下，6 種玉米赤霉烯酮類毒素的提取回收率為87%～105%。

圖3 提取液對(duì)牛奶中玉米赤霉烯酮類毒素回收率的影響（n=3）Fig. 3 Recoveries of zeranols in milk with different extraction solvents (n = 3)

2.4 凈化方式的選擇

牛奶中存在大量的干擾物質(zhì)，C18可用來(lái)去除牛奶中的脂肪和酯類等，PSA可去除脂肪酸、有機(jī)酸、色素、糖等極性物質(zhì)。同時(shí)，提取液中還含有大量水分，使用無(wú)水硫酸鎂去除水分。因此本試驗(yàn)對(duì)C18、PSA、無(wú)水硫酸鎂的吸附凈化效果進(jìn)行研究。

吸附劑的質(zhì)量對(duì)于減少基質(zhì)干擾和提高回收率有重要作用，對(duì)此本研究分別對(duì)PSA、C18以及無(wú)水硫酸鎂的用量進(jìn)行優(yōu)化。在10 μg/kg添加量下分別使用40、60、80、150、200 mg的PSA、C18和無(wú)水硫酸鎂對(duì)2.3節(jié)1%乙酸-乙腈提取液進(jìn)行凈化，結(jié)果見圖4。圖4a給出了PSA用量變化時(shí)6 種玉米赤霉烯酮類毒素回收率的變化情況，PSA在40 mg時(shí)6 種毒素的回收率均較低且重復(fù)性差，60～80 mg時(shí)回收率在70%～120%之間且去除干擾效果較好，但當(dāng)用量大于60 mg時(shí)，重復(fù)性相對(duì)較差。圖4b對(duì)C18的用量進(jìn)行優(yōu)化，可以看出，C18的用量與回收率成正比，隨著用量的增多回收率也逐漸增高，用量大于80 mg時(shí)6 種毒素的重復(fù)性均較差，在80 mg時(shí)回收率在70%～120%范圍內(nèi)且回收率高于40 mg和60 mg。圖4c中顯示無(wú)水硫酸鎂對(duì)回收率的影響很明顯，在40～60 mg以及100～150 mg時(shí)回收率比80 mg和200 mg的回收率低，但是200 mg的重復(fù)性較差，因此本實(shí)驗(yàn)原則使用80 mg無(wú)水硫酸鎂。

在10 μg/kg添加水平下使用不同比例的吸附劑對(duì)牛奶中玉米赤霉烯酮類毒素凈化效果、回收率及重復(fù)性進(jìn)行比較，結(jié)果如圖5所示。將上述結(jié)果60 mg PSA、80 mg C18、80 mg無(wú)水硫酸鎂（質(zhì)量比3∶4∶4）組合使用與甄振鵬等[19]實(shí)驗(yàn)中使用的PSA、C18、無(wú)水硫酸鎂質(zhì)量比1∶1∶1相比，前者的凈化效果、回收率和重復(fù)性均較好。因此，本研究最終選擇PSA、C18和無(wú)水硫酸鎂的用量分別是60、80 mg和80 mg。

圖4 吸附劑質(zhì)量對(duì)牛奶中6 種玉米赤霉烯酮類毒素回收率的影響Fig. 4 Effect of sorbent dosage on recoveries of six zeranols from milk

圖5 吸附劑比例對(duì)牛奶中6 種玉米赤霉烯酮類毒素回收率的影響Fig. 5 Effect of sorbent composition on recoveries of zeranols from milk

2.5 基質(zhì)效應(yīng)測(cè)定結(jié)果

在HPLC-MS/MS色譜柱上被洗脫出的含有提取液的共流出物（包括基質(zhì)成分），會(huì)與目標(biāo)離子相互競(jìng)爭(zhēng)液滴表面，導(dǎo)致該目標(biāo)物出現(xiàn)離子化效率降低或增強(qiáng)，造成響應(yīng)的降低或升高，最終出現(xiàn)基質(zhì)抑制效應(yīng)或增強(qiáng)效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)建立了添加量0.1、0.5、1、5、10、20、50 μg/kg的溶劑和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過比較兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率判定基質(zhì)效應(yīng)，計(jì)算公式如下：

根據(jù)受到基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱，將基質(zhì)效應(yīng)分為3 類：基質(zhì)效應(yīng)低于－20%表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)；基質(zhì)效應(yīng)介于－20%和20%之間表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)；基質(zhì)效應(yīng)高于20%表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。結(jié)果表明：6 種玉米赤霉烯酮類毒素中α-ZAL表現(xiàn)弱的增強(qiáng)效應(yīng)，其余化合物表現(xiàn)抑制效應(yīng)，具體見表2。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇使用基質(zhì)匹配外標(biāo)法消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)物的影響。

表2 牛奶中6 種玉米赤烯酮醇類毒素的基質(zhì)效應(yīng)（n=7）Table 2 Matrix effect for six zeranols in milk (n =7))

2.6 定量方式及線性關(guān)系

由于存在基質(zhì)效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)則以陰性牛奶樣品提取液作為溶劑配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。在陰性樣品中添加目標(biāo)化合物，按照給定的方法測(cè)定，在0.1～50 μg/L線性范圍以信噪比RSN為3對(duì)應(yīng)添加水平作為檢出限，信噪比RSN為10對(duì)應(yīng)的添加水平作為定量限，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示該方法的檢出限在0.05～0.1 μg/kg之間，定量限在0.25～0.5 μg/kg之間。

表3 6 種玉米赤霉烯酮類毒素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear ranges, calibration equations, correlation coeffificients,LODs and LOQs for six zeranols

2.7 準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，使用陰性牛奶為空白樣品，分別選擇添加定量限的1、2 倍和10 倍的玉米赤霉烯酮類毒素，按前述方進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)測(cè)定，每個(gè)添加量實(shí)驗(yàn)測(cè)定6 個(gè)平行。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)，均扣除本底值后計(jì)算添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。6 種玉米赤霉烯酮類毒素在牛奶中的添加回收率為91.8%～114.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.2%～14.4%之間，結(jié)果見表4。