間隙連接蛋白32對結腸癌侵襲和轉移的影響

陳思宇，張強，李妍

1重慶醫科大學附屬長壽人民醫院消化內科，重慶401220

2陸軍軍醫大學附屬第一醫院消化內科，重慶4000000

結腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，全球每年有超過120萬的新發病例，中國結腸癌發病率逐年上升，且呈年輕化的趨勢，即使接受根治術治療，仍有20%～40%的患者出現肝轉移，成為治療的難點及主要的致死因素[1-3]。腫瘤細胞發生侵襲和轉移時，細胞表型會發生上皮細胞-間充質轉化（epithe-lial-mesenchymal transition，EMT），減弱了腫瘤細胞的極性及細胞間緊密連接，且可同時表達多種侵襲和轉移相關蛋白，導致腫瘤細胞逃離原發灶，向遠處轉移[4-5]。

研究表明，多種蛋白均可參與腫瘤細胞的EMT過程，其中間隙連接蛋白家族能夠維持細胞的上皮表型，抑制腫瘤細胞的EMT過程[6]。由間隙連接蛋白介導的細胞間通訊能夠調節細胞的新陳代謝，傳遞增殖和分化信號，可調控腫瘤細胞的多種生理過程。間隙連接蛋白32（connexin 32，CX32）作為間隙連接蛋白家族的重要成員之一，在結腸癌細胞中異常表達，與結腸癌臨床分期以及腫瘤細胞的侵襲和轉移過程密切相關[7]。CXC趨化因子受體 4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）表達于細胞膜，可被基質細胞衍生因子1（stromal cell-derived factor 1，SDF1）激活，從而將細胞外的信號轉導至細胞內；CXCR4還可通過激活細胞內的G蛋白偶聯受體引發級聯反應，激活CXCR4的增殖和轉移信號。Src是CXCR4信號通路的核心效應分子，而磷酸化Src（phospho-Src，p-Src）的激活可直接調控CXCR4信號通路。本研究探討CX32對結腸癌細胞侵襲和轉移的影響及可能的作用機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3月至2017年12月在重慶醫科大學附屬長壽人民醫院收治的結腸癌患者。納入標準：①均接受結腸癌根治術治療，并取得結腸癌組織標本；②術后病理確診為結腸癌；③臨床及隨訪資料完整。排除標準：術前均未接受放化療。依據納入和排除標準，本研究共納入47例結腸癌患者，其中男23例，女24例；年齡38～73歲；Dukes分期：A～B期16例，C～D期31例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期11例，Ⅲ～Ⅳ期36例；淋巴結轉移32例，無淋巴結轉移15例；遠處轉移39例，無遠處轉移8例。

1.2 細胞和主要試劑

人結腸癌LoVo細胞系購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）細胞庫，CX32過表達載體購自美國Addgene公司，兔抗人CX32、兔抗人CXCR4、兔抗人Src、兔抗人p-Src和兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體均購自美國CST公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學染色法檢測CX32和CXCR 4蛋白的表達情況 取結腸癌組織石蠟標本連續切片脫蠟水化，3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，微波修復，室溫下血清封閉。加入一抗（稀釋濃度為1∶100），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）代替一抗作為陰性對照，4℃冰箱過夜，次日常溫下孵育二抗，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。隨機選取10個高倍視野（×100），采用Mattern積分法評估CX32蛋白的陽性表達情況：①細胞陽性率評分，陽性細胞所占比例＜10%為0分，10%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～100%為3分；②免疫組織化學染色強度評分，無著色為0分，淡黃色為1分，深黃色為2分，棕褐色為3分；將細胞陽性率評分和免疫組織化學染色強度評分相加得最終總分，總分≤3分為陰性表達，總分>3分則為陽性表達。采用IPP軟件對免疫組織化學染色樣本中陽性染色區域進行定量計算，并進行Spearman相關性分析。

1.3.2 生物信息學分析 結腸癌患者基因表達數據下載自TCGA數據庫，根據數據庫中765例結腸癌患者CX32mRNA表達數據，將本研究中的47例結腸癌患者按照數據庫中界定的相對表達量（11071）分為高表達組和低表達組。同時通過基因集合富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）網站（http://software.broadinstitute.org）下載與結腸癌侵襲相關的基因子集，該基因集中基因均為侵襲性結腸癌組織中呈上調表達的基因。采用GSEA 3.0軟件對結腸癌組織中CX32的表達與結腸癌細胞侵襲相關基因的關系進行基因富集分析。1.3.3細胞培養及轉染方法 采用含90%DMEM和1%雙抗（100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素）及10%胎牛血清的培養基培養人結腸癌LoVo細胞系，置于37℃、5%CO2恒溫恒濕的培養箱中培養。待細胞融合度約為80%時，胰蛋白酶消化傳代。將CX32過表達載體轉染至人結腸癌LoVo細胞系，作為研究組，未作處理的細胞作為對照組，繼續培養24～48 h，用于后續實驗。

1.3.4 蛋白質印跡法（Westernblot）檢測CX32、CXCR 4、Src、p-Src蛋白的相對表達量 取研究組和對照組結腸癌LoVo細胞，裂解液裂解，提取細胞總蛋白，采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）80 V恒壓電泳2 h，250 mA恒流1.5 h將目的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗（稀釋濃度為1∶1000），4℃孵育過夜；次日室溫孵育1 h，洗膜3次，加入相應二抗室溫孵育2 h，洗膜3次后顯影。采用Image J軟件測量每個條帶的灰度值，以GAPDH為內參，以目的條帶與內參條帶灰度值比值表示CX32、CXCR4、Src、p-Src蛋白的相對表達量。

1.3.5 Transwell小室檢測細胞侵襲能力 取研究組和對照組結腸癌LoVo細胞，胰蛋白酶消化后，無血清培養基重懸，調整細胞濃度為5×105/ml，取200 μl細胞懸液加入鋪好Matrigel膠的Transwell上室中，下室加入600 μl含20%血清的培養基，37℃孵育24 h，棉簽擦去上室的非遷移細胞，移出Transwell小室，倒置風干，甲醛固定30 min，采用0.1%結晶紫染色15 min，PBS沖洗，倒置風干觀察。細胞侵襲能力采用IPP軟件進行評估，該軟件可對圖片的染色區域進行分析，計算積分光密度（integral optical density，IOD）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件對所有數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；相關性分析采用Spearman相關性分析；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同臨床特征結腸癌患者CX32蛋白陽性表達情況的比較

Mattern積分法結果顯示，CX32陰性表達34例，CX32陽性表達13例。不同性別、Dukes分期結腸癌患者CX32陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；不同TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移情況結腸癌患者CX32陽性表達率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征結腸癌患者CX32陽性表達情況的比較（ n=47）

2.2 CX32表達與結腸癌患者臨床特征的相關性

相關性分析結果顯示，CX32陽性表達與TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移均呈明顯正相關（r=0.540、0.680、0.490，P＜0.01）；CX32陽性表達與性別和Dukes分期無相關性（r=0.023、0.017，P＞0.05）。

2.3 CX32與結腸癌細胞侵襲的關系

基因富集分析發現，與結腸癌細胞侵襲相關的基因子集多數富集在CX32低表達的藍色區域，CX32的表達與結腸癌細胞侵襲呈負相關，標準化富集得分（normalizedenrichmentscore，NES）=-1.034，標準化P值=0.04。（圖1）

圖1 CX32與結腸癌侵襲相關的基因富集分析

2.4 CX32與CXCR 4蛋白表達的關系

根據TCGA數據庫CX32mRNA的相對表達水平界值，將本研究47例結腸癌患者分為高表達組（n=23）和低表達組（n=24例），高表達組患者CX32mRNA的相對表達量為（13025±103），明顯高于低表達組患者的（9782±97），差異有統計學意義（t=18.571，P＜0.01）。免疫組織化學染色結果顯示，低表達組患者中，腫瘤組織的形態更加紊亂，腫瘤細胞雜亂聚集，惡性程度更高，CXCR4的分布更加廣泛；而在高表達組患者中，腫瘤組織的形態更加規則，腫瘤細胞的分布更加均勻，且CXCR4的表達也較局限（圖2）。低表達組結腸癌患者CXCR4的相對表達量為（8874.56±156.12），明顯高于高表達組患者的（1256.34±105.48），差異有統計學意義（t=9.785，P＜0.01）。Spearman相關性分析結果顯示，CX32的表達與CXCR4呈明顯負相關（r=-0.720，P＜0.01）。

圖2 低表達組和高表達組結腸癌患者CXCR 4蛋白的表達情況（免疫組織化學染色，×100）

2.5 C X32、CXCR 4、Src、p-Src蛋白相對表達量的比較

研究組LoVo細胞CX32蛋白的相對表達量明顯高于對照組細胞，差異有統計學意義（P＜0.01）；且研究組LoVo細胞CXCR4和p-Src蛋白的相對表達量均低于對照組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 對照組和研究組細胞CX32、CXCR 4、Src、p-Src蛋白相對表達量的比較（ ± s）

表2 對照組和研究組細胞CX32、CXCR 4、Src、p-Src蛋白相對表達量的比較（ ± s）

組別對照組研究組t值P值CX32 0.01±0.00 0.15±0.01 19.256 0.003 CXCR4 3.05±0.01 0.98±0.01 9.896 0.002 Src 1.89±0.02 1.78±0.02 1.297 0.086 p-Src 2.05±0.01 1.23±0.02 15.687 0.015

2.6 細胞侵襲能力的比較

Transwell小室檢測結果顯示，研究組細胞陽性著色的平均IOD值為（688.51±69.32），低于對照組的（2024.38±99.81），差異有統計學意義（t=13.516，P＜0.05）。Spearman相關性分析結果顯示，CX32表達與細胞侵襲能力呈明顯負相關（r=-0.750，P＜0.01）。

3 討論

結腸癌是中國最常見的惡性腫瘤之一，發病率逐年上升，嚴重威脅人類的生命健康[8]。間隙連接蛋白廣泛參與機體的生理和病理活動，可通過形成細胞間隙連接通訊，進行細胞間信號轉導，為物質代謝提供通道，在乳腺癌、胃癌、皮膚癌等多種惡性腫瘤中異常表達[9]。研究表明，CX32表達下調與結腸癌細胞的侵襲和轉移密切相關[7]。本研究結果顯示，CX32的表達與結腸癌患者TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移均呈明顯正相關。為探討CX32的表達對結腸癌細胞侵襲和轉移的影響，本研究將CX32表達載體轉染至LoVo細胞，結果顯示，研究組細胞陽性著色的平均IOD低于對照組，發現原本侵襲能力較強的LoVo細胞在過表達CX32后侵襲能力明顯減弱，表明CX32可明顯抑制結腸癌細胞的侵襲能力。

結腸癌細胞的侵襲和轉移是其惡性表型的重要體現，也是導致結腸癌難治及易復發的重要因素。結腸癌細胞接受趨化信號刺激后，細胞內侵襲轉移的相關信號通路被激活，導致腫瘤細胞脫離了原發病灶，向遠處轉移。CXCR4是腫瘤細胞最重要的趨化因子受體之一，在骨腫瘤、腦腫瘤、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤中表達水平均較高，在結腸癌中也存在選擇性表達的情況，CXCR4表達上調與結腸癌的侵襲和轉移密切相關[10-11]。本研究通過基因富集分析發現，CXCR4等結腸癌侵襲相關基因在CX32低表達患者中明顯富集，此外CX32的表達與CXCR4呈明顯負相關，表明CX32可能通過抑制CXCR4的信號通路來抑制結腸癌細胞的侵襲和轉移。Src是CXCR4下游的重要蛋白激酶，也是人類最早發現的腫瘤蛋白之一，Src在受到CXCR4的刺激后，可將細胞外的信號傳遞至細胞內，導致G蛋白偶聯受體發生構象改變，促進包括Src在內的多種蛋白激酶發生磷酸化，引起侵襲和轉移相關信號通路的級聯反應[12-13]。本研究通過 Western blot法檢測 CX32、CXCR4、Src、p-Src蛋白的相對表達量，結果顯示，研究組細胞p-Src的相對表達量低于對照組細胞，表明上調CX32的表達可明顯抑制CXCR4通路的活化。

綜上所述，CX32的表達與結腸癌的TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移均呈明顯正相關，上調CX32的表達可明顯抑制結腸癌細胞的侵襲能力。表明上調CX32的表達可能有助于提高結腸癌患者的治愈率，為結腸癌的診斷和治療提供新思路。此外，上調CX32的表達可能通過抑制CXCR4的表達，抑制其下游信號通路的活化，從而抑制結腸癌細胞的侵襲和轉移，但具體的作用機制尚需進一步探討。