尿沉渣中NLRP 3基因在膀胱癌診斷中的價值

汪曉巍，白伊娜，陳梅，李麗平

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院1檢驗科，2免疫內(nèi)科實驗室，北京1007300

NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（nucleotide binding oligomerization-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）是近年來發(fā)現(xiàn)的NLRP家族中的重要成員，能夠識別病原體及組織損傷相關(guān)的分子[1]。NLRP3主要分布于細(xì)胞間質(zhì)和細(xì)胞膜中，可以參與多種宿主的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。NLRP3激活后可以與凋亡相關(guān)斑點樣蛋白、半胱天冬氨酸酶-1等蛋白質(zhì)分子組裝形成多聚復(fù)合物——炎癥小體，從而促進(jìn)白細(xì)胞介素-1等炎性因子的分泌及細(xì)胞凋亡的發(fā)生，誘發(fā)劇烈炎癥反應(yīng)。NLRP3炎癥小體異常激活與腫瘤、自身免疫疾病等多種重大疾病密切相關(guān)。細(xì)胞角蛋白20（cytokeratin 20，CK20）是細(xì)胞角蛋白家族中的重要成員，具有很強(qiáng)的組織特異性，表達(dá)于尿道上皮細(xì)胞的表層和中間層，由于膀胱癌（bladder cancer，BCa）細(xì)胞很容易脫落到尿液中，因此，CK20可以作為BCa的腫瘤標(biāo)志物。本研究旨在明確BCa患者尿沉渣中NLRP3基因的表達(dá)情況，并通過與CK20基因進(jìn)行比較，探討NLRP3基因在診斷BCa中的應(yīng)用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年4月至2017年1月中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院收治的52例初發(fā)BCa患者為BCa組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①初發(fā)BCa；②行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)；③術(shù)后病理證實為非肌層浸潤性BCa。排除標(biāo)準(zhǔn)：復(fù)發(fā)性BCa或肌層浸潤性BCa。選取同期于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院治療的55例膀胱炎患者為CTR1組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有尿頻、尿急和尿痛病史；②尿液常規(guī)檢查可見紅細(xì)胞、膿細(xì)胞。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴隨其他泌尿生殖系統(tǒng)感染。選取同期于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院行健康體檢的53例健康者為CTR0組。納入標(biāo)準(zhǔn)：無器質(zhì)性病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：血常規(guī)和尿常規(guī)有異常值。BCa組患者中，男43例，女9例；平均年齡（60.2±10.7）歲。CTR1組患者中，男32例，女23例；平均年齡（53.5±11.0）歲。CTR0組中，男31例，女22例；平均年齡（52.3±11.7）歲。所有受試者均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

總RNA提取試劑盒購自加拿大Norgen Biotek公司；Qubit RNA HS Assay Kit購自美國Life Technologies公司；ABI 7900 Real-Time PCR System購自美國Applied Biosystems公司；SuperscriptⅢ和SYRB GreenER qPCR SuperMix Universal購自美國Invitrogen公司

1.3 尿液標(biāo)本收集和RNA提取

采集BCa患者手術(shù)當(dāng)日晨尿中段尿，采集膀胱炎患者和健康者檢查或體檢當(dāng)日晨尿中段尿。將尿液標(biāo)本于4℃下2000×g離心10 min，收集沉淀并采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗2次；隨后將沉淀溶于300 μl裂解緩沖液中保存。總RNA提取按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用Qubit RNA HS Assay Kit定量后，儲存于-80℃冰箱備用。

1.4 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測NLRP 3、CK20基因的表達(dá)水平

總RNA依照總RNA提取試劑盒說明書使用SuperscriptⅢ逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為65℃5 min，50℃ 50 min，85℃ 5 min，37℃ 20 min；將cDNA儲存于-20℃冰箱備用。將NLRP3和CK20作為靶基因，以β-actin為內(nèi)參基因，使用ABI 7900 Real-Time PCR System進(jìn)行實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）。引物及序列如下所示：β-actin正向引物為 3'-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-5'，βactin反向引物為3'-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-5'；CK20正向引物為 3'-AAGGAGCATCAGGAGGAAGTC-5'，CK20反向引物為 3'-GCCTGGAGCAGCATCAAC-5'；NLRP3正向引物為3'-CGGGGCCTCTTTTCAGTTCT-5'，NLRP3反向引物為3'-CCCCAACCACAATCTCCGAA-5'。SYRB GreenER qPCR SuperMix Universal反應(yīng)體系為20 μl，按照95℃ 3 min后95℃ 1 min，55℃ 2 min，循環(huán)40次。每個樣品重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，ΔCt靶基因=Ct靶基因-Ctβ-actin。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，3組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，3組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價NLRP3、CK20基因檢測對BCa的診斷效能。所有統(tǒng)計均為雙尾，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尿沉渣中NLRP 3 mRNA和CK20 mRNA表達(dá)水平的比較

3組受試者尿沉渣中NLRP3mRNA、CK20mRNA的表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（H=20.107，P=0.011；H=21.502，P=0.039）。3組間兩兩比較結(jié)果顯示：BCa組尿沉渣中NLRP3mRNA的表達(dá)量明顯高于CTR0組和CTR1組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（U=734.5，P=0.002；U=908.5，P=0.002）。BCa組尿沉渣中CK20mRNA的表達(dá)量明顯高于CTR0組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（U=680.5，P=0.001）；BCa組尿沉渣中CK20mRNA的表達(dá)量高于CTR1組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（U=1232.0，P=0.166）。（表1）

表1 3組受試者尿沉渣中NLRP 3 mRNA和CK20 mRNA的表達(dá)量[M（ P25， P75）]

2.2 尿沉渣中NLRP 3、CK20基因?qū)Ca的診斷效能分析

繪制ROC曲線，確定NLRP3和CK20基因的最佳截斷值，并計算區(qū)別BCa患者與健康者及膀胱炎患者的靈敏度和特異度，結(jié)果顯示：在綜合靈敏度和特異度的情況下，選擇10.0為NLRP3基因的截斷值，其ROC曲線下面積為0.726（95%CI：0.634～0.799），診斷BCa的靈敏度為47.4%，特異度為86.5%，陽性預(yù)測值為62.5%，陰性預(yù)測值為77.5%。選擇9.0為CK20基因的截斷值，其ROC曲線下面積為 0.717（95%CI：0.627～0.788），診斷 BCa的靈敏度為50.0%，特異度為82.0%，陽性預(yù)測值為56.5%，陰性預(yù)測值為77.2%。將NLRP3值＞10.0且CK20值＞9.0作為聯(lián)合診斷標(biāo)準(zhǔn)，其ROC曲線下面積為0.748（95%CI：0.659～0.823），診斷BCa的靈敏度為61.5%，特異度為75.9%，陽性預(yù)測值為55.5%，陰性預(yù)測值為80.4%。（圖1）

圖1 尿沉渣中NLRP 3、CK20基因單獨及聯(lián)合檢測診斷BCa的ROC曲線

3 討論

BCa是世界上第7位最常見的腫瘤，每年有43萬新發(fā)腫瘤病例和超過16.5萬的腫瘤死亡病例[2]。BCa的診斷主要基于膀胱鏡和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查（voided urine cytology，UVC）[3]。但UVC的缺點在于其診斷BCa的靈敏度較低（30%～92%），針對低度惡性的腫瘤，UVC的靈敏度僅為30%～40%[4]。雖然UVC是BCa的非侵入性診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是膀胱鏡檢查依然是診斷BCa的主要手段。膀胱鏡檢查具有微創(chuàng)、有痛感的特點，并且是一種潛在的傳染過程。因此，尋找BCa早期診斷和判斷預(yù)后的新方法是泌尿系統(tǒng)腫瘤研究的一大挑戰(zhàn)，其可以為改善BCa患者的治療結(jié)果及降低醫(yī)療服務(wù)成本提供有力的支持。

目前，現(xiàn)有的BCa標(biāo)志物的靈敏度大都優(yōu)于UVC，但特異度較低，如核基質(zhì)蛋白22（nuclear matrix protein 22，NMP22）、TRAK、細(xì)胞角質(zhì)蛋白19片段抗原21-1（cyto-keratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1）等[5]。在所有候選的BCa生物標(biāo)志物中，CK20是一種低分子量蛋白，表達(dá)于尿道上皮細(xì)胞的表層和中間層，多項研究證實尿液中CK20蛋白和mRNA均可以作為BCa的腫瘤標(biāo)志物[6-7]。還有研究表明，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，15%以上的腫瘤都有慢性炎癥反應(yīng)參與其中，而以NOD樣受體（nucleotide binding oligomerization domain-like receptor，NLR）為代表的模式識別受體在多種生理過程中發(fā)揮作用，特別是通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)等方式影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境由炎癥細(xì)胞和免疫活性細(xì)胞組成[8]。其中，NLR和Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）蛋白是炎癥小體的關(guān)鍵成分，是促炎因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白細(xì)胞介素-18（interleukin-18，IL-18）產(chǎn)生和成熟的分子平臺[9]。NLRP3炎癥小體是目前研究最廣泛的一種蛋白，在多種疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，包括黑色素瘤、骨髓瘤、結(jié)直腸癌等多種腫瘤[10]。在黑色素瘤中，抑制NLRP3炎癥小體的活性，可以抑制腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[11]。在骨髓瘤中，NLRP3-caspase 1-IL-1β軸的表達(dá)紊亂與腫瘤進(jìn)展相關(guān)[12]。在結(jié)直腸癌組織中，NLRP3的表達(dá)水平明顯降低，并有研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸炎小鼠模型中，NLRP3基因敲除小鼠更易患結(jié)腸癌，而結(jié)腸癌細(xì)胞敲除NLRP3基因后，細(xì)胞的運動性增強(qiáng)[13-14]。NLRP3影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制可能與自噬及自然殺傷細(xì)胞活性有關(guān)，更深入的分子機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。本研究觀察了BCa患者尿沉渣中NLRP3、CK20的mRNA表達(dá)情況，并評估了兩者單獨及聯(lián)合檢測在BCa診斷中的價值。

本研究結(jié)果顯示，BCa組尿沉渣中NLRP3mRNA、CK20mRNA的表達(dá)量均明顯高于CTR0組（P＜0.01），BCa組尿沉渣中NLRP3mRNA的表達(dá)量明顯高于膀胱炎組（P＜0.01），推測NLPR3作為炎癥小體在從慢性炎癥發(fā)展為腫瘤的過程中可能發(fā)揮了一定的作用。通過ROC曲線，本研究發(fā)現(xiàn)NLRP3、CK20基因診斷BCa的靈敏度分別為47.4%（NLRP3基因截斷值為10.0）和50.0%（CK20基因截斷值為9.0），而兩者聯(lián)合檢測診斷BCa的靈敏度達(dá)61.5%，均優(yōu)于目前常用的細(xì)胞學(xué)診斷方法。在特異度方面，兩者聯(lián)合的表現(xiàn)也優(yōu)于新發(fā)現(xiàn)的幾種標(biāo)志物[15]。表明NLRP3、CK20基因可以作為新的候選腫瘤標(biāo)志物用于BCa的臨床診斷，且上述兩種指標(biāo)彌補(bǔ)了現(xiàn)有UVC方法和其他分子標(biāo)志物在靈敏度和特異度方面的不足[5]，為發(fā)現(xiàn)新的臨床診斷方法提供了可能。但是目前對于NLRP3與BCa患者臨床特征的關(guān)系，及其能否預(yù)測BCa預(yù)后尚無相關(guān)報道，故仍需進(jìn)一步的研究。

綜上所述，炎癥小體是腫瘤發(fā)生過程中的一個關(guān)鍵因素，NLRP3可能是一個潛在的BCa早期診斷工具，特別是與CK20聯(lián)合應(yīng)用。由于本研究納入的樣本量較少，故仍需要樣本量更大更深入的研究來明確NLRP3的診斷價值，為BCa的診斷提供新方法。