β-catenin及EZH 2陽性表達在原發性肝細胞肝癌中的診斷價值△

曾東，馮艷玲，鄭葉，楊月香，石雨涵

上海市（復旦大學附屬）公共衛生臨床中心病理科，上海2015080

原發性肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種高病死率的疾病，是較為常見的肝臟惡性腫瘤之一，嚴重威脅患者的生命安全[1]。但HCC在發病早期不易確診，且多被患者忽視，因此有效的早期篩查是降低HCC致死風險的主要手段[2]。隨著醫療水平的進步，血液相關因子診斷受到重視。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是診斷原發性HCC的特異性腫瘤標志物，但部分肝硬化患者的AFP表達水平也會出現異常增高，同時20%的晚期肝癌患者直至病死前，AFP的表達仍處于較低水平[3]。β-聯蛋白（β-catenin）、zeste 2多梳抑制復合物2亞基增強子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2）和信號轉導及轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）均為肝癌發生發展過程中的重要調節因子，在肝癌的診療中扮演重要角色，因此為了選擇能夠輔助AFP確診HCC的血液相關因子，本研究采用β-catenin與EZH2聯合診斷后再聯合AFP的診斷方案，取得了較佳的診斷效果，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年1月至2019年1月于上海市（復旦大學附屬）公共衛生臨床中心接受檢查的疑似HCC的患者92例。納入標準：所有患者均具有肝炎病史，無淋巴結轉移，無其他合并癥。排除標準：伴嚴重黃疸、遠處轉移；凝血功能障礙；伴嚴重感染。92例患者中，經穿刺病理檢查確診HCC 50例，肝硬化23例，肝血管瘤19例。50例HCC患者中，男性31例，女性19例；年齡46～68歲，平均（54.5±5.3）歲；TNM分期[4]：Ⅰ期18例，Ⅱ期32例。42例非HCC患者中，男性25例，女性17例；年齡44～69歲，平均（53.8±6.0）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。本研究通過上海市（復旦大學附屬）公共衛生臨床中心倫理委員會審查，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

所有HCC患者于入院時采集清晨空腹靜脈血2 ml并儲存至-80℃冰箱，采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（購自美國Sigma公司）檢測β-catenin和EZH2的濃度，采用美國貝克曼庫爾特全自動生化分析儀檢測AFP的表達情況，AFP＞25ng/ml定義為陽性。50例HCC患者均于術后取腫瘤組織和相應癌旁組織（距腫瘤邊緣1 cm），23例肝硬化患者采用手術穿刺方法取肝硬化組織，19例肝血管瘤患者采用穿刺方法取正常肝組織。所有組織石蠟包埋后，采用免疫組織化學法測定β-catenin、EZH2和STAT3的陽性表達情況[5]。

1.3 免疫組織化學結果判定

每例標本隨機選擇10個高倍視野（×400），分別計數100個腫瘤細胞，判斷β-catenin、EZH2和STAT3蛋白在各組織中的陽性表達情況。陽性表達指數為陽性細胞所占百分比評分及細胞質染色強度評分相加。陽性細胞所占百分比評分：無陽性細胞為0分，≤25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。細胞質染色強度評分：無色為0分，淺黃色為1分，深黃色為2分，棕黃色為3分。陽性表達指數＞3分為陽性，≤3分為陰性。

1.4 觀察指標

以穿刺病理檢查結果為“金標準”，分析各指標診斷HCC的靈敏度、特異度、準確度、陽性預測值、陰性預測值和Kappa值。靈敏度=真陽性例數/（真陽性+假陰性）例數×100%，特異度=真陰性例數/（真陰性+假陽性）例數×100%，準確度=（真陰性+真陽性）例數/（真陽性+真陰性+假陽性+假陰性）例數×100%，陽性預測值=真陽性例數/（真陽性+假陽性）例數×100%，陰性預測值=真陰性例數/（真陰性+假陰性）例數×100%。本研究采用βcatenin和EZH2聯合診斷，兩種診斷指標均為陽性則判為陽性，否則為陰性；β-catenin和EZH2聯合診斷后的結果再與AFP聯合診斷，前者結果與AFP中有一個為陽性即可判為陽性，否則為陰性。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，相關性分析采用Pearson相關分析法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 β-catenin、EZH 2、AFP對HCC的診斷價值

β-catenin單獨診斷HCC的準確度、靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、Kappa值分別為67.4%、78.0%、54.8%、67.2%、67.6%、0.33，EZH2單獨診斷HCC的上述指標分別為66.3%、70.0%、61.9%、68.6%、63.4%、0.32；二者與AFP聯合診斷HCC的上述指標分別為89.1%、90.0%、88.1%、90.0%、88.1%、0.78。（表1）

表1 β-catenin、EZH 2單獨及聯合AFP診斷HCC與病理診斷結果的對照

2.2 不同組織中 β-catenin及EZH 2陽性表達情況的比較

HCC組織中β-catenin和EZH2陽性表達率均高于正常組織、肝硬化組織和癌旁組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）；肝硬化組織中β-catenin和EZH2陽性表達率均高于正常組織和癌旁組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同組織中 β-catenin及EZH 2陽性表達情況的比較[ n（%）]

2.3 血漿與HCC組織中 β-catenin及EZH 2表達的相關性

HCC組織中β-catenin陽性表達及陰性表達患者的血漿β-catenin表達水平分別為（315.0±27.8）、（96.2±11.2）ng/L，HCC組織中EZH2陽性表達及陰性表達患者的血漿EZH2表達水平分別為（632.5±99.5）、（169.3±22.9）ng/L。經Pearson相關性分析可知，血漿中β-catenin及EZH2的表達情況與HCC組織中陽性表達情況均呈正相關（r=0.638、0.920，P＜0.05）。2.4 HCC組織中STAT 3與 β-catenin及EZH 2表達的相關性

經Pearson相關性分析可知，HCC組織中STAT3的表達與β-catenin及EZH2的表達均呈正相關（r=0.652、0.423，P＜0.05）。（表3）

表3 HCC組織中STAT 3、 β-catenin及EZH 2的表達情況

3 討論

β-catenin在人類的胚胎發育和腫瘤形成中具有重要的作用[6]。當細胞接受外界條件刺激時，β-連環蛋白 1（catenin beta 1，CTNNB1）基因表達上調，使下游因子β-catenin表達升高，隨后β-catenin被絲氨酸磷酸化激活，提高腫瘤細胞的轉移能力和侵襲能力[7]。而EZH2是多梳抑制復合體2（polycomb repressive complex 2，PRC2）的甲基化酶亞基，其過表達和突變均可以誘發、促進腫瘤的發生和進展[8]。而上述兩種因子雖然在多種惡性腫瘤中高表達，但二者是否能夠作為早期篩查指標，且組織和血漿中的表達關聯性研究鮮有報道。AFP是診斷HCC的常用指標，但仍有20%的HCC患者出現漏診[9]。因此，本研究將β-catenin與EZH2先聯合診斷后再與AFP聯合進行HCC的診斷，結果發現該方案診斷靈敏度、特異度、準確度均在80%以上，且Kappa值＞0.6，與二者單獨診斷相比，診斷價值高。HCC組織中β-catenin與EZH2的陽性表達率均高于癌旁組織、肝硬化組織和正常肝組織，提示β-catenin和EZH2在原發性HCC組織中的陽性表達率較高，聯合診斷HCC具有一定輔助指導意義。但通常情況下，臨床實踐中會選擇更方便的診斷方式，而組織取材過于繁瑣且會對患者造成創傷，可接受度不高[10]。血液檢查是常用的檢查方式，因此本研究觀察了HCC患者組織和血液中β-catenin和EZH2表達的相關性，發現二者在血漿和組織中的表達均呈正相關，且相關性較強，提示血液中β-catenin和EZH2的表達也可以作為HCC的輔助診斷手段。

STAT3是信號轉導及轉錄激活因子家族的重要成員，在多種腫瘤細胞中被激活且過表達[11]。本研究中STAT3與β-catenin和EZH2表達均呈正相關。提示β-catenin和EZH2在HCC中高表達可能與STAT3有關。有研究顯示，STAT3可能旁作用于WNT經典信號通路從而激活β-catenin的表達[12]。相似地EZH2能夠通過加強STAT3的磷酸化使其過表達，從而促進腫瘤細胞生長[13]。還有研究顯示，EZH2能夠通過激活STAT3從而增強腎細胞癌的侵襲能力[14]。

綜上所述，β-catenin和EZH2在原發性HCC組織中表達水平較高，可以作為原發性HCC的輔助診斷手段，能夠提高AFP診斷的準確度，且STAT3可能參與了β-catenin和EZH2的高表達過程。