GLI 1、p-STAT 3蛋白在膽囊癌患者中的表達情況及與臨床特征的關系

彭寧，何松青，尚麗明，肖開銀

廣西醫科大學第一附屬醫院肝膽外科，廣西 南寧5300210

膽囊癌是膽道系統的惡性腫瘤，病因復雜，治愈難度較大，發病率較高，發病機制復雜。研究發現，膽囊癌的發生發展過程涉及多個基因[1]。慢性炎癥、結石、結腸炎及膽囊息肉等均可導致膽囊癌。早期膽囊癌無特異性，多數患者確診時已處于晚期，治愈率較低，對化療不敏感，術后生存率較低。研究顯示，膽囊癌發病率逐年上升，其發生發展過程與神經膠質瘤相關癌基因同源物1（glioma-associated oncogene homolog 1，GLI1）和磷酸化信號轉導及轉錄激活因子3（phosphorylated-signal transduction and activator of transcription 3，p-STAT3）等分子有關[2]。GLI1屬于轉錄因子，可調控Hedgehog信號通路下游基因的轉錄過程[3]。Hedgehog信號通路可促進胚胎發育及腫瘤的發生發展，GLI1可活化該信號通路的下游靶基因，在Hedgehog信號通路中具有關鍵的調節作用。本研究探討了GLI1和p-STAT3蛋白在膽囊癌中的表達情況及其與膽囊癌發生發展的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年6月至2017年6月廣西醫科大學第一附屬醫院收治的膽囊癌和慢性膽囊炎患者。納入標準：①膽囊癌的診斷標準參考人民衛生出版社《外科學》第八版[3]；②慢性膽囊炎的診斷標準參考《中國慢性膽囊炎、膽囊結石內科診療共識意見（2018年）》[4]；③Nevin分期為Ⅰ～Ⅳ期；④手術前未接受放化療或免疫治療；⑤臨床資料完整。排除標準：①轉移性膽囊癌；②合并其他部位惡性腫瘤；③合并免疫系統疾病或風濕性疾病。依據納入和排除標準，本研究共納入60例膽囊癌患者和60例慢性膽囊炎患者。膽囊癌患者中男20例，女40例；年齡38～79歲，平均年齡為（54.0±10.2）歲；腫瘤直徑：≥2 cm 37例，＜2 cm 23例；分化程度：高分化13例，中分化16例，低分化31例；Nevin分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期14例，Ⅲ期32例，Ⅳ期4例；淋巴結轉移43例，無淋巴結轉移17例。慢性膽囊炎患者中男17例，女43例，年齡40～79歲，平均年齡為（55.7±11.0）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫組織化學染色

取膽囊癌患者的膽囊癌組織標本，以及慢性膽囊炎患者的膽囊炎組織標本。將組織標本烤片后脫蠟水化，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗，常溫孵育，抗原修復，5%牛血清白蛋白封閉。兔抗人GLI1單克隆抗體與兔抗人p-STAT3單克隆抗體作為一抗，封閉過夜，PBS沖洗后，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔抗體作為二抗，室溫孵育2 h，PBS沖洗30～45 min。滴加HRP標記的鏈霉素卵白素工作液，常溫孵育，PBS沖洗，加入二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液，顯微鏡下控制顯色，顯色滿意后用蒸餾水沖洗。蘇木素染色后鹽酸乙醇浸泡分化，自來水沖洗后氨水返藍，自來水沖洗。切片依次放入75%、90%、100%乙醇中，10 min后二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 觀察指標和評估標準

GLI1、p-STAT3蛋白主要定位于細胞核或細胞質中，陽性表達根據陽性細胞所占比例及染色強度分別計分。按陽性細胞所占比例：≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；按染色強度：基本不著色為0分，呈淺黃色為1分，呈棕黃色為2分，呈褐色或黑色為3分；染色強度與陽性細胞所占比例評分相乘后得出綜合評分，綜合評分＜3分為陰性表達，≥3分為陽性表達。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件對所有數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GLI 1、p-STAT 3蛋白陽性表達情況的比較

膽囊癌組織中GLI1、p-STAT3蛋白的陽性表達率均明顯高于膽囊炎組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 膽囊癌和膽囊炎組織中GLI 1、p-STAT 3蛋白陽性表達情況的比較[ n（%）]

2.2 不同臨床特征膽囊癌患者膽囊癌組織中GLI 1、p-STAT 3蛋白表達情況的比較

不同性別、腫瘤直徑膽囊癌患者膽囊癌組織中GLI1、p-STAT3蛋白陽性表達率的比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。不同分化程度、Nevin分期、淋巴結轉移情況膽囊癌患者膽囊癌組織中GLI1蛋白陽性表達率比較，差異均有統計學意義（χ2=5.640、5.000、10.506，P＜0.05）；不同分化程度、Nevin分期、淋巴結轉移情況膽囊癌患者膽囊癌組織中p-STAT3蛋白陽性表達率比較，差異均有統計學意義（χ2=10.993、9.248、7.074，P＜0.05）。（表2）

3 討論

膽囊癌是一種病情較為復雜的膽道系統惡性腫瘤，包括腺癌、硬癌、乳頭癌、黏液癌及未分化癌等[4-6]。膽囊癌發病率較高，女性發病率高于男性，且病因復雜，慢性炎癥、細菌感染、膽囊結石、免疫遺傳和膽囊息肉等均被認為與膽囊癌的發生發展密切相關。膽囊癌的早期診斷較為困難，確診時多已經出現區域性的淋巴結轉移或腫瘤細胞已經侵襲機體的其他組織，處于晚期。目前，臨床多采用計算機斷層掃描（CT）作為膽囊癌的主要診斷方式，但對早期膽囊癌的診斷效能較低。為提高早期膽囊癌的診斷特異度，提高根治率，改善預后，需要對與膽囊癌有關的生物分子進行研究。

Hedgehog信號通路在膽囊癌發生發展及胚胎發育過程中發揮重要作用。該信號通路主要由配體聲波刺猬信號分子（sonic hedgehog signaling molecule，SHH）、跨膜蛋白Patched（PTCH）、跨膜蛋白Smoothened（SMO）、核轉錄因子GLI1構成[7-10]。若PTCH未與SHH結合，PTCH即可抑制SMO的活化，進而抑制Hedgehog信號通路的激活；若PTCH與SHH結合，PTCH對SMO的抑制作用消失，促進SMO的釋放，激活PTCH下游轉錄因子GLI1，促進GLI1向細胞核內轉移，從而激活Hedgehog信號通路[11]。Hedgehog信號通路的過度活化可導致腫瘤惡化，促進腫瘤細胞增殖并增強其耐藥性。研究表明，GLI1在Hedgehog信號通路中具有關鍵的調節作用，GLI1在膽囊癌細胞中高表達，而在正常的膽囊細胞中不表達[12]。

信號轉導及轉錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）是一種信號轉導蛋白，與細胞的生理生化、免疫調節及腫瘤的發生發展有關。正常情況下，機體內的STAT3激活快速且短暫，信號通路轉導途徑較復雜。STAT3主要受機體內外因素的影響而持續激活，可出現非正常、非生理性的基因調控紊亂，對機體造成重大創傷，甚至誘發腫瘤。機體含有多種的細胞因子和生長因子，其酪氨酸基因位點磷酸化后被激活，受體介導的核轉錄因子STAT3也發生磷酸化，即p-STAT3，并在細胞膜SH2的作用下，形成同源二聚體或異源二聚體。細胞質中的二聚體可進入細胞核，特異性的DNA片段被識別并結合，從而調控靶基因的轉錄，誘導惡性腫瘤相關基因的表達[13]。研究顯示，腫瘤細胞中的STAT3被激活后，可呈持續激活狀態；而正常機體的生理環境中的STAT3被激活后，其激活狀態僅能維持極其短暫的時間[14-15]。

本研究中，膽囊癌組織中GLI1、p-STAT3蛋白的陽性表達率均明顯高于膽囊炎組織，表明STAT3是膽囊癌重要參與因子，為臨床防治膽囊癌提供了可能性。GLI1、p-STAT3表達水平較高可能提示膽囊癌的高侵襲性及強轉移能力。低分化、Nevin分期為Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結轉移的膽囊癌患者膽囊癌組織中GLI1、p-STAT3蛋白的陽性表達率均高于中高分化、Nevin分期為Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結轉移的膽囊癌患者，表明GLI1、p-STAT3可能與膽囊癌的分化程度有關。

綜上所述，GLI1、p-STAT3蛋白在膽囊癌組織中陽性表達率較高，且可能與膽囊癌的分化程度、Nevin分期和淋巴結轉移有關。