p16蛋白在宮頸癌中的表達及其與患者臨床特征和預后的關系

李偉英，范長玲，張敏，陳月芳

儋州市人民醫院1婦產科，2病理科，3檢驗科，海南 儋州5717990

宮頸癌是女性生殖系統腫瘤中發病率最高的惡性腫瘤，大多數患者確診時已是宮頸浸潤癌。宮頸浸潤癌多見于圍絕經期婦女[1]。近年來，宮頸癌的發病率逐漸升高，且呈現年輕化趨勢[2]。宮頸細胞學檢查等篩查方法能夠發現大量的早期宮頸病變，是預防宮頸癌的有效方法。影像學檢查能夠對宮頸病變的范圍和浸潤情況進行評估。目前，腫瘤基因學是臨床研究和基礎研究領域的熱點。有研究發現，腫瘤抑制基因p16的活性與宮頸癌的發生、發展及預后密切相關[3]。本研究擬探討p16蛋白與宮頸癌患者臨床特征和預后的關系，旨在為臨床診療宮頸癌提供參考依據。現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2010年10月至2015年10月儋州市人民醫院收治的116例宮頸癌患者，所有患者的宮頸癌組織標本均經活檢或手術采集。所有患者明確病理性質后均采取宮頸癌根治術，并根據宮頸癌分期決定是否采取術后放化療。納入標準：經臨床診斷為宮頸癌，并經組織病理學檢查證實；均為初診，且參與本研究前未行放療或化療。排除標準：年齡＞70歲；存在子宮先天畸形；合并其他部位惡性腫瘤。116例宮頸癌患者的年齡為26～62歲，平均年齡為（43.52±7.25）歲；病理類型：鱗癌46例，腺癌38例，腺鱗癌32例；宮頸癌分期：Ⅰ期62例，Ⅱ期54例；分化程度：低分化38例，中高分化78例；有淋巴結轉移37例，無淋巴結轉移79例。另選取100例行子宮全切術且無宮頸病變的子宮肌瘤患者的正常宮頸組織標本。納入標準：臨床擬診為子宮肌瘤，并經組織病理學檢查確診。排除標準：子宮肌瘤累及宮頸，存在宮頸病變；存在子宮先天畸形；合并其他部位惡性腫瘤。子宮肌瘤患者的年齡為35～69歲，平均年齡為（44.13±6.55）歲。兩組患者的年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究獲得本院醫學倫理委員會審核批準，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》，向所有患者及其家屬介紹了研究的目的、方法及注意事項，所有患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學染色方法

采用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接（streptavidin-perosidase，SP）法檢測p16蛋白的表達情況。所有組織標本采用10%福爾馬林固定，常規取材，石蠟包埋，將蠟塊以4 μm厚度進行切片，經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，微波修復抗原，蒸餾水沖洗后加鼠抗人p16單克隆抗體（購自武漢博士德生物工程有限公司）和存活蛋白（survivin）單克隆抗體（購自美國Labvision公司），4℃孵育12 h，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，每次5 min，加入50 μl二抗（羊抗鼠抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司），25℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，室溫下滴加二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑（購自福州邁新生物技術開發有限公司）顯色3～5 min，自來水沖洗，終止顯色，PBS浸洗3次，每次2 min，蘇木素復染1～2 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于BX41高倍鏡下閱片并拍攝。以PBS代替血清為陰性對照，已知陽性切片為陽性對照，對p16蛋白表達情況進行判定。

1.3 免疫組織化學染色結果判定標準及觀察指標

參考相關文獻[3]評價p16蛋白的陽性結果：p16蛋白陽性定位主要在細胞核，也可定位在細胞質，陽性細胞表現為細胞內出現黃色或棕黃色顆粒。根據陽性細胞所占百分比分為陰性（-）（＜25%）、弱陽性（+）（25%～50%）、中等陽性（++）（51%～70%）和強陽性（+++）（＞70%）。其中，“+～+++”定義為p16蛋白陽性表達。綜合陽性細胞所占百分比和染色強弱進行評價，陰性：陽性細胞所占百分比＜25%，染色較淡；陽性：陽性細胞所占百分比≥25%，染色較深。觀察和比較宮頸癌組織和正常宮頸組織中p16蛋白的表達情況，分析p16蛋白表達與宮頸癌患者臨床特征（包括患者的年齡、腫瘤直徑、病理類型、宮頸癌分期、宮頸癌分化程度、淋巴結轉移情況）的關系，觀察p16蛋白表達與宮頸癌患者預后的關系。采用定期門診或電話隨訪的方式對患者進行隨訪，隨訪截止日期為2018年12月，隨訪1～92個月，中位隨訪時間為60個月。

1.4 統計學分析

采用SPSS 25.0軟件對數據進行統計分析，計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存情況的比較采用Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌組織和正常宮頸組織中p16蛋白表達情況的比較

宮頸癌組織中p16蛋白的陽性表達率為89.66%（104/116），明顯高于正常宮頸組織的9.00%（9/100），差異有統計學意義（χ2=140.043，P＜0.01）。（表 1）

表1 不同宮頸組織中 p16蛋白的表達情況[ n（%）]

2.2 p16蛋白的陽性表達情況與宮頸癌患者臨床特征的關系

不同年齡、腫瘤直徑、病理類型、宮頸癌分期宮頸癌患者宮頸癌組織中p16蛋白的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；分化程度為低分化、有淋巴結轉移宮頸癌患者宮頸癌組織中p16蛋白的陽性表達率均高于分化程度為中高分化、無淋巴結轉移的宮頸癌患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

2.3 p16蛋白表達與宮頸癌患者預后的關系

p16蛋白陰性表達宮頸癌患者共12例，其中，因腫瘤復發死亡1例，p16蛋白陰性表達患者的3年生存率為91.7%。p16蛋白陽性表達宮頸癌患者共104例，其中，因腫瘤復發或轉移死亡39例，p16蛋白陽性表達患者的3年生存率為62.5%。經Logrank檢驗，結果顯示，p16蛋白陰性表達患者的生存情況優于p16蛋白陽性表達患者，差異有統計學意義（χ2=3.896，P＜0.05）。（圖1）

表2 p16蛋白陽性表達與宮頸癌患者臨床特征的關系（ n=116）

圖1 p16蛋白陰性表達（ n=12）和陽性表達（ n=104）宮頸癌患者的生存曲線

3 討論

盡管正常宮頸組織進展為宮頸癌的時間長達8～12年，但宮頸癌患者預后較差，中國每年約有2萬女性死于宮頸癌[4]。早期篩查和早期治療宮頸癌一直是提高臨床治愈率、降低病死率的關鍵[5]。p16是調控細胞周期的蛋白，參與細胞的增殖和分裂過程[6]。p16蛋白表達異常或活性異常會導致細胞發生惡性增殖，有研究證實p16蛋白參與肺癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的發生和發展過程[7]。

本研究結果顯示，宮頸癌組織中p16蛋白的陽性表達率明顯高于正常宮頸組織（P＜0.01），提示p16蛋白的陽性表達與宮頸癌的發生密切相關，通過干預p16蛋白的表達可能抑制宮頸癌細胞的增殖。p16蛋白通過競爭性結合細胞周期依賴性激酶調節細胞周期，抑制惡變細胞的增殖和分化，防止惡性腫瘤的發生[8-9]，當p16基因失活時，p16蛋白的表達活性下降，導致細胞周期紊亂、細胞癌變[10-13]。p16蛋白在宮頸鱗狀上皮癌前病變及柱狀上皮癌前病變和宮頸癌組織中均有廣泛表達，相關報道顯示p16蛋白在宮頸癌組織中呈高表達，其表達與人乳頭狀瘤病毒2級（human papilloma virus，HPV）感染有關，HPV能夠導致pRb蛋白失活，從而刺激p16蛋白的表達水平升高[14-15]。p16蛋白檢測可鑒別宮頸上皮內瘤變2級（cervical intraepithelial neoplasia 2，CIN2）、宮頸鱗癌和子宮內膜鱗癌，也可鑒別宮頸腺癌和子宮內膜腺癌，大大提高了對宮頸癌癌前病變的診斷準確率[16-17]。

本研究分析了p16蛋白與宮頸癌患者臨床特征的關系，發現低分化、有淋巴結轉移宮頸癌患者宮頸癌組織中p16蛋白的陽性表達率均明顯高于中高分化、無淋巴結轉移的宮頸癌患者，提示p16蛋白不僅參與宮頸癌的發生，還參與宮頸癌侵襲、轉移的發展過程。但是本研究未發現p16蛋白陽性表達與宮頸癌患者年齡、腫瘤直徑、病理類型、宮頸癌分期的關系，推測其原因可能與本研究患者年齡普遍偏低有關。然而，有大量研究發現p16蛋白的陽性表達與宮頸癌患者的年齡有關，年齡越大，p16蛋白的陽性表達率越高，分析原因可能與年齡的分層標準存在差異有關[18-20]。本研究發現，p16蛋白陽性表達患者和p16蛋白陰性表達患者的生存情況表現出明顯的差異，p16蛋白陽性表達患者的生存率較低，提示p16蛋白是宮頸癌患者不良預后的預測因子。

綜上所述，宮頸癌組織中p16蛋白的陽性表達率較高，其陽性表達可能與宮頸癌患者的分化程度、淋巴結轉移有關，p16蛋白陰性表達患者的生存情況更優，p16蛋白可作為評價宮頸癌患者病情和預后的有效指標。本研究尚存在諸多不足之處，如本研究納入的樣本量較少，且對患者的隨訪時間較短，因此有待日后擴大樣本量做進一步深入且長期的研究。