擬南芥CTSP3基因GUS載體構建及轉基因植株的篩選鑒定

孟云 陶曼芝 吳席 曹樹青 樊婷婷

摘要[目的]深入研究植物基因CTSP3的基因表達模式及其對重金屬鎘脅迫的響應機制，以野生型擬南芥為材料構建CTSP3-GUS重組質粒及GUS轉基因植株。[方法]通過提取野生型擬南芥的DNA，克隆其啟動區(qū)基因片段，將基因片段和pART27-GUS質粒雙酶切后連接，轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，菌落PCR和測序獲得陽性單克隆。然后將CTSP3-GUS重組質粒轉入農桿菌感受態(tài)GV3101，獲得陽性單菌落。接著采用浸花法侵染野生型擬南芥，最后通過抗性篩選和PCR鑒定獲取CTSP3-GUS轉基因植株。[結果]成功克隆CTSP3啟動區(qū)基因片段，構建出重組質粒，獲得了CTSP3-GUS轉基因植株。 [結論]獲得CTSP3-GUS轉基因植株，為接下來進一步研究該基因在植物響應鎘脅迫機制中的功能奠定了基礎。

關鍵詞擬南芥;CTSP3;載體;轉基因植株

中圖分類號Q939.9文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）03-0084-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.027

重金屬污染已經成為世界性重大環(huán)境問題之一，其中重金屬鎘污染尤為嚴重。過多的鎘會對動植物細胞組織造成不可逆的損傷[1-3]。在重金屬鎘逆境中，植物通過控制金屬流入、促進金屬泵出、重金屬螯合等途徑來應激[4]。運用植物轉基因技術對植物品種進行優(yōu)化改良是解決重金屬污染的最佳方式[5]。研究發(fā)現(xiàn)CTSP3功能缺失突變體對重金屬鎘脅迫表現(xiàn)出耐受的表型，所以筆者擬通過克隆CTSP3啟動區(qū)基因，獲得CTSP3-GUS植株，以進一步研究植物基因CTSP3的基因表達模式及其對重金屬鎘脅迫的響應機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1材料。植物材料是哥倫比亞（Columbia， col）遺傳背景的擬南芥（Arabidopsis thaliana），從美國擬南芥種質資源中心獲得，由合肥工業(yè)大學植物分子生物學實驗室繁殖所得。載體構建所用質粒pART27-GUS，大腸桿菌DH5α，農桿菌GV3101。

1.1.2主要試劑及酶類。

Plasmid? miniprep Kit （TIANGEN），T4-DNA Ligase（NEB），PrimeSTAR HS DNA Polymerase（TaKaRa），限制性內切酶Kpn Ⅰ（NEB），Hind Ⅲ（NEB），Easy Taq DNA Polymerase（TransGen），Agar， DNA loading buffer，異丙醇，氯仿，無水乙醇等。

1.2方法

1.2.1擬南芥無菌苗培養(yǎng)。

配制1/2MS固體培養(yǎng)基，取出存儲于4 ℃冰箱的1/2MS培養(yǎng)基，按比例稱取蔗糖瓊脂和1/2MS，溶解調pH至5.8，封膜后高壓蒸汽滅菌，滅菌結束后倒培養(yǎng)基至玻璃培養(yǎng)皿中。用0.1%氯化汞對種子殺菌消毒后，將種子均勻點在已凝固的培養(yǎng)基中。4 ℃冰箱中春化2 d，在恒溫（22 ℃左右）培養(yǎng)室中光照豎直培養(yǎng)14 d，定期觀察擬南芥生長情況。

1.2.2擬南芥DNA的提取。將培養(yǎng)皿中的擬南芥取出，放入研缽中，加650 μL已預熱的CTAB，研磨至溶液狀裝入管中。65 ℃水浴45?? min拿出靜置到室溫，加入650 μL酚氯彷劇烈混勻，離心吸取上清液，加900 μL無水乙醇，上下顛倒混勻，-20 ℃沉淀2 h。離心，棄上清后加75%乙醇，離心，棄上清，倒置使殘留乙醇完全揮發(fā)。加入40 μL無菌水溶解DNA，獲得DNA溶液。

1.2.3CTSP3啟動區(qū)基因片段的克隆。

利用Oligo 7.0軟件設計以下引物進行CTSP3啟動區(qū)基因片段的克隆。上游引物為FP：5′-CGGGGTACCTCTTCAGTAGTAACGTTGCG-3′，下游引物為RP：5′-CCCAAGCTTTTCCTCTCTACCTTCTT-3′，以DNA為模板進行基因克隆。

1.2.4大腸桿菌的轉化。

取出-80 ℃冰箱中存儲的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，置于冰上解凍。解凍后，吸取10 μL質粒或連接產物加入到感受態(tài)細胞中，混勻，冰浴35? min，42 ℃水浴60 s，再冰上靜置2 min。加600 μL無菌未加抗性的LB液體培養(yǎng)基，放在37 ℃搖床中低速振蕩培養(yǎng)1～2 h。待菌液渾濁后，涂布于LB+壯觀霉素的平板上。平板倒置放在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

過夜培養(yǎng)后挑取培養(yǎng)皿單菌落，接種于LB+壯觀霉素的液體培養(yǎng)基中，渾濁后PCR鑒定和測序。

1.2.5農桿菌的轉化。

取出存儲于冰箱中的農桿菌GV3101感受態(tài)細胞，解凍。取2 μL質粒加入到感受態(tài)細胞中，混勻，吸取至已預冷的0.1 cm電擊杯中，電擊后迅速加入600 μL無菌未加抗性的LB液體培養(yǎng)基，28 ℃搖床培養(yǎng)1～2 h至渾濁，涂布于LB+壯觀霉素的平板上，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)皿上挑取單菌落接種于LB+壯觀霉素的液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)渾濁，PCR鑒定。

1.2.6花序侵染法獲取轉基因擬南芥。

將陽性農桿菌接種于含壯觀霉素的LB培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)至OD600=1.2～1.4，離心去上清，用侵染緩沖液重懸至溶液OD600=0.8～1.2，最后加入一定量的SilwettL-77混勻，侵染花序，黑暗處理12 h。隔8 d，再次侵染。

1.2.7轉基因陽性植株鑒定。

將獲得的擬南芥種子置于含有卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基中進行抗性篩選，培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，將具有根且子葉顏色嫩綠的幼苗移栽至土質培養(yǎng)基中，提取DNA，經PCR鑒定正確后，即獲得轉基因陽性植株。

2結果與分析

2.1擬南芥CTSP3啟動區(qū)基因片段的克隆

為了驗證CTSP3基因在擬南芥鎘耐受機理中的作用，構建CTSP3-GUS載體。以野生型擬南芥DNA為模板，通過PCR技術擴增CTSP3啟動區(qū)基因片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示，所選取啟動區(qū)長度1 928 bp，與PCR所得片段大小一致。

2.2目的片段和質粒雙酶切

基因擴增引物設計時，在上下游引物分別添加了限制性內切酶Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ的酶切位點保護堿基，使用限制性內切酶Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ對基因克隆獲得CTSP3啟動區(qū)基因片段和pART27-GUS質粒同時進行雙酶切。酶切以后，電泳檢測，酶切后的基因片段和載體質粒條帶清晰，大小正確（圖2）。

2.3連接和大腸桿菌轉化后陽性克隆鑒定

T4連接酶將酶切后的基因片段與質粒片段連接，連接產物采取熱擊法導入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)過夜后挑取單克隆菌落于加有相應抗性的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至菌液渾濁。

對上一步所得單克隆菌液PCR鑒定，所用引物為CTSP3啟動區(qū)片段擴增引物，結果如圖3所示。除了2號與5號菌落，其他菌落PCR條帶與CTSP3啟動區(qū)基因片段大小一致，說明其為陽性克隆。選取1號菌液進行測序，結果與CTSP3啟動區(qū)序列完全吻合，說明成功構建CTSP3-GUS載體。

2.4農桿菌轉化及花序浸染

將測序正確的CTSP3 -GUS重組質粒通過電擊法轉化入農桿菌GV3101，培養(yǎng)在慶大霉素和壯觀霉素抗生素培養(yǎng)基，挑取單菌落PCR驗證。電泳結果如圖4所示，所選單克隆菌株均為陽性單菌落。

2.5CTSP3 -GUS轉基因植株的抗性篩選

獲取侵染后的擬南芥種子，37 ℃干燥，4 ℃春化后撒在含有卡那霉素抗性的MS平板上。恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，長出來的小苗（具有長根，子葉顏色嫩綠）可能為轉基因陽性植株，如圖5所示。

2.6CTSP3 -GUS轉基因陽性植株的鑒定

將篩選出陽性植株移載至土壤中，置于專用培養(yǎng)室中恒溫光照培養(yǎng)，20 d后提取轉基因植株DNA，進行鑒定。PCR鑒定結果如圖6所示，篩選所得植株均為轉基因陽性植株，即CTSP3-GUS轉基因植株。

3討論

土壤重金屬污染是世界性的重大問題，鎘作為基本礦物質元素[6]，通過礦物吸收機制進入細胞。土壤鎘污染直接危害植物生長、動物和人類的健康[7]。目前，植物修復法是治理鎘污染最有效的方法。

該試驗自擬南芥種子資源中心獲得CTSP3基因功能缺失型突變體[8-10]，前期研究結果顯示CTSP3基因參與了植物對

鎘脅迫的響應，因此通過基因工程技術構建CTSP3-GUS重組載體[11-12]，將其轉入野生型擬南芥中，從而獲得轉基因植株。這為研究CTSP3基因在植物中的表達模式和鎘耐受調節(jié)機制中的作用提供了依據(jù)，是一個非常關鍵的課題。

參考文獻

[1] SHIM D， HWANG J U， LEE J，et al.Orthologs of the class A4 heat shock transcription factor HsfA4a confercadmium tolerance in wheat and rice[J].Plant cell，2009，21：4031-4043.

[2] TAMS L，MISTRK I，ALEMAYEHU I A.Low Cd concentrationactivated morphogenic defence responses are inhibited by high Cd concentration-induced toxic superoxide generation in barley root tip[J].Planta，2014，239（5）：1003-1013.

[3] CHEN F，WANG F，WU F B，et al.Modulationof exogenous glutathione in antioxidant defense system against Cd stress in the two barley genotypes differing in Cd tolerance[J].Plant Physiol Biochem，2014，48（8）：663-672.

[4] STRAIF K， BENBRAHIMTALLAA? L， BAAN? R，et al.A? review of human carcinogensPart C：Metal， arsenic， dusts， and fibres[J].Lancet? Oncol，2009，10（5）：453-454.

[5] KHNLENZ T，SCHMIDT H，URAGUCHI S，et al.Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase 2 is constitutively active in vivo and can rescue the growth defect of the PCS1deficient cad13 mutant on Cdcontaminated soil[J].J Exp Bot，2014，65（15）：4241-4253.

[6] HALL J L.Cellular mechanisms for heavy metal detoxificationandtolerance[J].J Exp Bot，2002，53：1-11.

[7] CLEMENS S.Molecular mechanisms of plant metal tolerance and homeostasis[J].Planta，2001，212（4）：475-486.

[8] BELHAJ K， CHAPARROGARCIA A， KAMOUN S， et al.Plant genome editing made easy：Targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system [J].Plant methods， 2013， 9（1）：1-10.

[9] SIEMIANOWSKI O，BARABASZ A，KENDZIOREK M，et al.HMA4 expression in tobacco reduces Cd accumulation due to the induction of the apoplastic barrier[J].J Exp Bot，2014，65（4）：1125-1139.

[10] YAO J，KONG Q N，ZHU H Y，et al.Content and fractionation of Cu， Zn and Cd in size fractionated municipal solid waste incineration bottom ash[J]. Ecotox Environ Safe，2013，94：131-137.

[11] ZIENTARA? K，? WAWRZYN'SKA? A，UKOMSKA? J，et al.Activity of the AtMRP3 promoter in transgenic Arabidopsis thaliana and Nicotiana tabacum plants is increased by cadmium， nickel， arsenic， cobalt and lead but not by zinc and iron[J].J Biotechnol，2009，139（3）：258-263.

[12] ZHAI Z Y， GAYOMBA S R， JUNG H I，et? al.OPT3 is a phloemspecific? iron transporter that is essential for systemic iron signaling and redistribution of iron and cadmium in Arabidopsis[J].Plant cell，2014，26：2249-2264.