小秦艽花中總環烯醚萜和總酚酸的含量測定

楊倩 趙偉剛 王曉琴

摘要[目的]建立小秦艽花中總環烯醚萜和總酚酸含量測定的方法，并測定10個藥材樣品中的含量。[方法]分別以龍膽苦苷和沒食子酸為對照品，建立紫外分光光度法測定總環烯醚萜和總酚酸含量的方法。[結果]10批小秦艽花樣品中環烯醚萜含量為67.95～155.16 mg/g;總酚酸含量為9.54～17.04 mg/g。[結論]2種含量測定方法操作簡便，精密度、重現性良好，結果準確可靠，可用于評價小秦艽花的質量以及資源利用價值。

關鍵詞小秦艽花;總烯醚萜;總酚酸;含量測定

中圖分類號R282.71文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）03-0183-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.057

小秦艽花，為龍膽科龍膽屬植物達烏里龍膽（小秦艽）Gentiana dahurica Fisch.的干燥花[1]。2015版《中國藥典》中將小秦艽與大葉秦艽（G.macrophylla Pall.）、粗莖秦艽（G.crassicaulis Duthie）、麻花秦艽（G.straminea Maxim）作為中藥秦艽的基源植物，以干燥根入藥[2]。秦艽始載于《神農本草經》，列為中品，性味苦、平，微寒，歸胃、肝、膽經，具有祛風濕、清濕熱、止痹痛、退虛熱的功效。而在藏藥志和蒙藥志中，秦艽組植物多以干燥花入藥，具有清熱解毒、止咳祛痰的功效。秦艽花在藏藥中應用普遍，有時會和小秦艽花混用。小秦艽花，蒙藥名呼和-朱立根-其木格，是蒙醫專屬用藥，用于肺熱咳嗽、咽喉腫痛、毒熱、瘟熱等癥[3]。

國內外學者的研究表明，秦艽基源植物的化學成分主要以環烯醚萜苷、三萜類和黃酮類為主。中藥秦艽（達烏里龍膽的根）和全草的成分主要為環烯醚萜、三萜類、黃酮類和苯甲酸衍生物等[4-6]。在前期的研究中[7]，首次從小秦艽花中分離鑒定出40多個五環三萜類成分、環烯醚萜類、黃酮類和以沒食子酸為代表的酚酸類成分，已經基本明確其主要次生代謝產物類型。另據文獻報道[8]，以龍膽苦苷為代表的環烯醚萜類化合物具有一定的抗炎作用，可視為秦艽類藥材抗炎的主要有效成分。目前以龍膽苦苷和沒食子酸為對照品分別測定小秦艽花總環烯醚萜和總酚酸含量的方法均鮮見報道。筆者建立小秦艽花中總環烯醚萜和總酚酸的含量測定方法，為蒙藥小秦艽花進一步的品質評價研究、規范化種植、臨床應用和復方藥物研發提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。10批小秦艽花藥材分別購買于河北安國藥材公司、內蒙古蒙藥材公司，或采集于內蒙古自治區，由內蒙古醫科大學渠弼教授鑒定為達烏里龍膽（Gentiana dahurica Fisch.）的干燥花;該研究中含量測定方法學考察所用藥材為1號樣品（購買于內蒙古蒙藥材公司）。

1.1.2主要儀器。 UVmini-1280型紫外可見分光光度計（日本島津）;AL-204型分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）;超聲波提取器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.1.3主要試劑。龍膽苦苷對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號K16D7B26927，供含量測定用）;沒食子酸對照品（中國藥品生物制品鑒定所，批號110831-200302，供含量測定用）。十二烷基硫酸鈉、三氯化鐵、鐵氰化鉀、鹽酸和其他試劑均為分析純;試驗用水為蒸餾水。

1.2方法

1.2.1總環烯醚萜含量的測定方法。

1.2.1.1對照品溶液的制備。精密稱取龍膽苦苷對照品5.20 mg置于25 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成208 μg/mL的對照品溶液，貯藏于4 ℃冰箱備用。

1.2.1.2供試品溶液的制備。取小秦艽花藥材粉末（3號篩）約0.1 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，稱重，超聲提取30 min，冷卻至室溫，補足失重，過濾，取續濾液0.15 mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得供試品溶液。

1.2.1.3吸收波長的確定。分別精密量取供試品溶液0.3 mL，對照品溶液2 mL置于10 mL容量瓶中，甲醇溶液定容，搖勻。以甲醇溶液作為空白對照，于200～400 nm波長進行掃描[9]。

1.2.1.4線性關系的考察。精密吸取“1.2.1.1”項下龍膽苦苷對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，以甲醇作為空白對照，于271 nm處測定吸光度。以吸光度差值為縱坐標、濃度（μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程。

1.2.1.5精密度試驗。 按“1.2.1.2”方法制備供試品溶液，并于271 nm處測定吸光度A，重復6次，計算峰面積的RSD。

1.2.1.6穩定性試驗。 按“1.2.1.2”方法制備供試品溶液，分別于溶液制備后0、10、20、30、40、50、60 min測定吸光度，計算總環烯醚萜含量和RSD。

1.2.1.7重復性試驗。 按“1.2.1.2”方法平行制備供試品溶液6份，于271 nm處測定吸光度，計算總環烯醚萜含量和RSD。

1.2.1.8加樣回收率試驗。取藥材粉末9份，每份約0.05 g，精密稱定，分別精密加入適量的龍膽苦苷對照品，按“1.2.1.2”方法制備供試品溶液，于271 nm處測定吸光度，計算平均回收率和RSD。

1.2.1.9樣品總環烯醚萜的含量測定。10個批次小秦艽花按“1.2.1.2”方法制備供試品溶液，于271 nm處測定吸光度，平行測定3次，計算含量。

1.2.2總酚酸的含量測定方法。

1.2.2.1對照品溶液的制備。精密稱取沒食子酸對照品5.80 mg置于25 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻后從中精密吸取1.0 mL溶液置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成23.2 μg/mL的沒食子酸對照品溶液，貯藏于4 ℃冰箱備用。

1.2.2.2供試品溶液的制備。取小秦艽花藥材（3號篩）粉末約0.1 g，精密稱定，置于100 mL圓底燒瓶中，加入95%甲醇25 mL，加熱回流2 h，冷卻至室溫，用95%甲醇補足減失重量，搖勻并過濾。

1.2.2.3顯色方法。精密吸取待測液適量于10 mL容量瓶中，加無水乙醇至2 mL，精密加0.3%十二烷基硫酸鈉0.8 mL、0.6% FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）3]（1.0∶0.9）混合溶液0.4 mL，搖勻，在暗處放置5 min后用0.1 mol/L HCl定容，搖勻，暗處放置20 min[10]。

1.2.2.4吸收波長的確定。分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各0.3 mL，顯色后，以顯色劑為空白，在200～800 nm波長進行掃描。

1.2.2.5標準曲線的繪制。精密吸取沒食子酸對照品溶液0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mL，顯色后，于743 nm處分別測定吸光度。以吸光度為縱坐標、濃度（μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程。

1.2.2.6精密度試驗。按“1.2.2.2”“1.2.2.3”方法制備供試品溶液并顯色，于743 nm處分別測定吸光度A，重復測定6次，計算峰面積的RSD。

1.2.2.7穩定性試驗。按“1.2.2.2”“1.2.2.3”方法制備供試品溶液并顯色，分別于顯色后0、15、20、25、30、35、40、45、50、55 min 測定吸光度，計算總酚酸含量和RSD。

1.2.2.8重復性試驗。取小秦艽花粉末6份，每份約0.1 g，精密稱定，按“1.2.2.2”“1.2.2.3”方法制備供試品溶液并顯色，于743 nm處測定吸光度，計算總酚酸含量和RSD。

1.2.2.9加樣回收率試驗。取藥材粉末9份，每份約0.05 g，精密稱定，分別精密加入適量的沒食子酸對照品，按照“1.2.2.2”“1.2.2.3”方法制備供試品溶液并顯色，于743 nm處測定吸光度，計算平均回收率和RSD。

1.2.2.10樣品總酚酸的含量測定。10個批次小秦艽花按“1.2.2.2”“1.2.2.3”方法制備供試品溶液并顯色，于743 nm處測定吸光度，平行測定3次，計算含量。

2結果與分析

2.1總環烯醚萜含量的測定

2.1.1吸收波長的確定。按“1.2.1.3”方法操作，結果顯示，對照品溶液與供試品溶液均在271 nm處有最大吸收，且無干擾，故選擇271 nm作為測定波長。

2.1.2線性關系考察。按“1.2.1.4”方法操作，得到回歸方程Y=0.018 2X-0.000 4（r= 0.999 0），表明龍膽苦苷在10.4～52.0 μg/mL與吸光度呈良好的線性關系。

2.1.3精密度試驗。按“1.2.1.5”方法操作， 計算得峰面積的RSD為0.08%，表明儀器精密度良好。

2.1.4穩定性試驗。按“1.2.1.6”方法操作，計算得總環烯醚萜含量的RSD為0.40%，說明供試品溶液在60 min內穩定性良好。

2.1.5重復性試驗。按“1.2.1.7”方法操作，計算得總環烯醚萜含量的RSD為0.60%，表明方法重復性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗。按“1.2.1.8”方法操作，計算平均回收率為96.42%，RSD為1.88%，表明該含量測定方法準確可靠。

2.1.7樣品總環烯醚萜的含量測定。由表1可知，10批小秦艽花樣品中總環烯醚萜含量為67.95～155.16 mg/g。

2.2總酚酸含量的測定

2.2.1吸收波長的確定。按“1.2.2.4”方法操作，結果發現，供試品溶液與對照品溶液的吸收曲線基本一致，在743 nm處均有最大吸收波長，且無干擾，故選擇743 nm作為測定波長。

2.2.2標準曲線的繪制。按“1.2.2.5”方法操作，計算得到回歸方程Y=0.493 9 X+0.001 7（r=0.999 6），表明沒食子酸在0.354～0.944 μg/mL與吸光度呈良好的線性關系。

2.2.3精密度試驗。按“1.2.2.6”方法操作，計算得峰面積的RSD為0.04%，表明儀器精密度良好。

2.2.4穩定性試驗。按“1.2.2.7”方法操作，計算得總酚酸含量在15～45 min的RSD為0.70%，說明供試品溶液在15～45 min穩定性良好。

2.2.5重復性試驗。按“1.2.2.8”方法操作，計算得總酚酸含量的RSD為0.20%，表明方法的重復性良好。

2.2.6加樣回收率試驗。按“1.2.2.9”方法操作，計算得出平均回收率為98.19%，RSD為0.75%，表明該含量測定方法準確可靠。

2.2.7樣品總酚酸的含量測定。由表1可知，10批小秦艽花樣品中總酚酸含量為9.54～17.04 mg/g。

3結論與討論

紫外分光光度法（比色法）是測定中藥和天然藥物中大類成分總含量的常見方法。張秀艷等[7]研究發現小秦艽花成分復雜多樣，大類成分主要為環烯醚萜類、五環三萜類、黃酮類和酚酸類成分。該研究分別建立了紫外分光光度法測定小秦艽花中總環烯醚萜和總酚酸含量的方法，并對野外采集實驗室陰干的藥材樣品以及購買于藥材市場的10批樣品進行了測定，結果發現，該研究建立的方法快捷、準確，以期為小秦艽花藥材的質量評價和資源利用提供科學依據。

該試驗對小秦艽花總環烯醚萜的提取條件進行了考察，對不同提取溶劑（先考察水、30%、50%、70%、100%甲醇;后考察40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%甲醇）、提取方法（超聲提取和回流提取）、提取時間（20、30、40、50、60 min）和取樣量（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g）等單因素進行考察，最終確定取樣量為0.1 g，加60%甲醇25 mL，超聲提取30 min為總環烯醚萜的最佳提取條件。

對小秦艽花總酚酸的提取條件進行了考察，對提取溶劑（先考察水、30%、50%、70%、100%甲醇;后考察80%、85%、90%、95%甲醇）、提取方法（超聲提取和回流提取）、提取時間（30、60、90、120 min）、回流次數（1、2、3次）和取樣量（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g）等單因素進行考察，確定0.1 g取樣量，加95%甲醇25 mL，回流2 h、回流1次為總酚酸的最佳提取條件。

參考文獻

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