蟲生真菌Isaria cateniannulata次級代謝產物及抗腫瘤活性研究

石佩星 李曉芳 解飛翔 張炳文

（1.河北大學生命科學學院，藥物化學與分子診斷教育部重點實驗室，河北保定 071002;2.河北大學藥學院，藥物質量控制河北省重點實驗室，河北保定 071002）

摘要[目的]對蟲生真菌環鏈棒束孢（Isaria cateniannulata）的次級代謝產物進行分離并研究其抗腫瘤活性。[方法]采用溶劑萃取、硅膠柱色譜、凝膠Sephadex LH-20等方法進行分離純化，根據理化性質和波譜技術對分離得到的化合物進行結構鑒定，利用MTT法對化合物的抗腫瘤活性進行測試。[結果]從蟲生真菌Isaria cateniannulata中共分離得到8個化合物，分別為β-麥角甾醇、豆甾-4-烯-3-酮、5α，8β-過氧-（22E，24R）-麥角甾-6，22-二烯3β-醇、4-methyl-5，6-dihydro-2H-pyran-2-one、（R）-甲羥戊酸內酯、對羥基苯甲醛、β-石竹烯和石竹烯氧化物。除化合物4外，其余化合物均是從該種中首次分離得到。抗腫瘤結果顯示，化合物7、8對腫瘤細胞具有一定的抑制能力。[結論]該研究為新的抗腫瘤藥物開發方面提供了廣闊空間。

關鍵詞蟲生真菌;環鏈棒束孢;倍半萜類化合物;抗腫瘤活性;結構鑒定

中圖分類號R284.1文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）03-0196-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.061

環鏈棒束孢（Isaria cateinannulata）是棒束孢屬中的一種非常重要的蟲生病原菌，而且在自然界中分布廣泛[1]。對該屬的研究主要以玫煙色棒束孢和粉棒束孢為主，而對環鏈棒束孢研究較少。到目前為止，對于環鏈棒束孢的報道較多集中在植物病蟲害防治領域，朱新燕等[2]對環鏈棒束孢不同菌株的固體培養條件進行研究;劉愛英[3]就環鏈棒束孢對于幾種昆蟲的治病效果進行研究，但對于環鏈棒束孢的次級代謝產物的系統研究鮮見報道。筆者為了尋找新型的具有抗腫瘤活性的化合物，采用溶劑萃取、硅膠柱色譜、凝膠Sephadex LH-20等方法對蟲生真菌環鏈棒束孢進行分離純化，根據理化性質和波譜技術對分離得到的化合物進行結構鑒定，并利用MTT法對化合物的抗腫瘤活性進行測試。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1儀器。旋轉蒸發儀R-210（瑞士BUCHI公司）;核磁共振儀AM-600（德國BRUKER公司）;雙層恒溫搖床ZHWY（上海智城分析儀器有限公司）;超凈工作臺ZHJH-C1112C（上海智城分析儀器有限公司）;薄層層析硅膠板（煙臺化學工業研究所）;柱層析硅膠（200～400目，煙臺化學工業研究所）;Sephadex LH-20（瑞典GE Healthcare公司）。

1.1.2培養基。PDA培養基：葡萄糖40 g，去皮土豆400 g，加蒸餾水至2 000 mL，pH 6.5。大米固體培養基：100 mL蒸餾水，80 g大米。

1.1.3

試驗菌株。該試驗所用菌種為環鏈棒束孢（Isaria cateniannulata），購自安徽農業大學，保存于河北大學藥物化學與分子診斷重點實驗室菌種庫。

1.1.4

供試腫瘤細胞株。人肝癌細胞（Huh-7）、人宮頸癌細胞（Hela）、人胃癌細胞（MGC-803）、人乳腺癌細胞（MCF-7）以及人肺癌細胞（A549）在-196 ℃液氮中凍存。

1.2試驗方法

1.2.1

發酵與分離。將Isaria cateniannulata菌種接種到PDA液體培養基中，于26 ℃、150 r/min恒溫搖床中培養6 d，得到3 L種子液。將3 L種子液以10%的接種量接種到大米培養基中（共30 L），室溫培養30 d，得到固體發酵物。

將Isaria cateniannulata的大米發酵物收集，以1.5倍的體積加入乙酸乙酯萃取，每次浸泡48 h，共萃取6次，合并萃取液，減壓濃縮得到浸膏107 g。將107 g浸膏與等體積硅膠拌勻，室溫下干燥。進行加壓柱層析，用石油醚/乙酸乙酯系統梯度洗脫[100∶0、20∶1、15∶1、10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1（V/V）]，經TCL檢測之后合并，得到Fr1～Fr5共5個部分。經反復硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠過濾、薄層TLC制備以及重結晶后得到化合物1～8。

1.2.2

活性篩選。將5個細胞株取出，置于37 ℃水浴鍋復蘇，待其解凍后吸出細胞懸液分別放入4個培養瓶中，加入細胞培養液。置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養。傳代培養3次，每3 d傳代一次，使細胞恢復健康狀態。胰酶消化細胞：用3 mL PBS清洗一次細胞，然后加入1 mL胰酶，37 ℃孵育1～3 min，終止消化。在96孔板中每孔接種100 μL，其含有8 000個細胞。第2天，觀察細胞密度，待細胞培養至匯合率80%左右，加藥處理。分別將化合物7、8母液進行梯度式稀釋，每孔加入2 μL各濃度樣品稀釋液，使其作用濃度分別為100.00、50.00、25.00、12.50、6.25 μL，每組設3個平行，同時設置陰性對照。樣品處理細胞24 h，避光每孔均加入20 μL MTT溶液。37 ℃培養箱中孵育4 h，然后每孔加入100 μL SDS-HCl，孵育過夜。在酶標儀SpectraMax M2上測試各孔570 nm的吸光度值。

抑制率=[（對照組OD570-樣品處理組OD570）/對照組OD570]×100%，根據寇式改良公式計算各個樣品相應細胞株的IC50，即死亡細胞數與總細胞之比為50%時所對應的樣品濃度。

2結果與分析

2.1結構鑒定該試驗通過對Isaria cateniannulata進行大米發酵培養，從其乙酸乙酯的萃取物中共分離到8個化合物，分別為化合物1（62.7 mg）、化合物2（22.7 mg）、化合物3（11.2 mg）、化合物4（9.7 mg）、化合物5（13.3 mg）、化合物6（21.5 mg）、化合物7（11.4 mg）、化合物8（2.2 mg）。化合物的結構見圖1。

2.2活性測試結果

對從蟲生真菌中分離得到的化合物7、8利用MTT法進行抗腫瘤活性測試。測試細胞分別為人胃癌細胞（MGC-803）、人乳腺癌細胞（MCF-7）、人肝癌細胞（Huh-7）、人宮頸癌細胞（Hela）和人肺癌細胞（A549），試驗結果如表1。從表1可以看出，化合物7對A549的半抑制濃度值（IC50）為80.44 μg/mL，表明化合物7對A549有一定的抑制作用;化合物8對MGC-803、MCF-7、Huh-7和Hela的IC50值分別為54.88、84.21、61.94、72.99 μg/mL，表明化合物8對Huh-7、Hela、MGC-803和MCF-7具有一定的抑制能力，但抑制能力較弱。

3結論

該研究對蟲生真菌環鏈棒束孢Isaria cateniannulata的次級代謝產物進行分離鑒定，共分離鑒定出8種化合物，分別為β-麥角甾醇、豆甾-4-烯-3-酮、5α，8β-過氧-（22E，24R）-麥角甾-6，22-二烯3β-醇、4-methyl-5，6-dihydro-2H-pyran-2-one、（R）-甲羥戊酸內酯、對羥基苯甲醛、β-石竹烯和石竹烯氧化物，其中8種化合物均為首次從該種中分離得到。對化合物7、8進行抗腫瘤活性測試，結果顯示，化合物7對A549具有一定的抑制能力，化合物8對Huh-7、Hela、MGC-803和MCF-7具有一定的抑制能力，但是抑制能力均較弱。

安徽農業科學2019年

參考文獻

[1] 張德龍，王小董，陸瑞利，等.液體或固體培養對環鏈棒束孢（Isaria cateinannulata）菌絲體中揮發性成分組成的影響[J].微生物學報，2011，51（12）：1616-1624.

[2] 朱新燕，李增智，樊美珍，等.3株環鏈擬青霉固體培養條件的研究[J].安徽農業大學學報，2008，35（1）：38-41.

[3] 劉愛英，陳月碧，梁宗琦，等.環鏈擬青霉和玫煙色擬青霉對菜青蟲致病條件的研究[J].貴州農業科學，1982（1）：57-59.

[4] 萬輝.褐圓孔牛肝菌化學成分的研究[J].中草藥，2000，31（5）：328-330.

[5] 李小軍，袁燕，李芝，等.苗藥冠蓋藤的化學成分研究[J].中草藥，2014，45（8）：1052-1055.

[6] 和東陽，王利勤.神黃豆果實化學成分的研究[J].中國現代應用藥學，2014，31（11）：1355-1359.

[7] YING Y M，ZHANG L W，SHAN W G，et al.Secondary metabolites of Peyronellaea sp.XW-12，an endophytic fungus of Huperzia serrata[J].Chem Nat Compd，2014，50（4）：723-725.

[8] 胡琳，丁智慧，劉吉開.灰黑擬牛肝菌的化學成分[J].云南植物研究，2002，24（5）：667-670.

[9] RAGASA C Y，ESPINEI D L，AGOO E M G，et al.Chemical constituents of Cinnamomum cebuense[J].Chin J Nat Med，2013，11（3）：264-268.

[10] RAGASA C Y，GANZON J，HOFILEA J，et al.A new furanoid diterpene from Caesalpinia pulcherrima[J].Chem Pharm Bull，2003，51（10）：1208-1210.