加米霉素含量測定方法的建立

張聰 姚路路 樊麗博 侯林

摘要[目的]建立用HPLC測定加米霉素含量的方法。[方法]采用高效液相色譜法，色譜柱為XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為磷酸鹽緩沖液（取0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液，用稀磷酸調節pH至8.0）-乙腈（30∶70），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃;檢測波長為205 nm。[結果]加米霉素在0.498 4～1.993 6 mg/mL（r=0.999 9）峰面積與濃度呈良好的線性關系，平均加樣回收率為99.2%，RSD=0.6%。[結論]該方法重復性良好，能準確測定加米霉素的含量。

關鍵詞加米霉素;含量測定;HPLC法

中圖分類號S859.79文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）03-0199-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.062

加米霉素是法國梅里亞公司開發研制的新一代半合成十五元氮雜環大環內酯類抗菌藥物，其注射液分別于2007、2010和2011年被歐洲藥品局（EMA）、加拿大保健產品與食品管理局（HPFB）和美國食品與藥品管理局（FDA）批準上市[1]，在中國，加米霉素注射液于2017年通過農業農村部進口獸藥注冊在國內上市銷售，用于治療和預防由溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌等主要病原菌引起的牛呼吸系統疾病[2-3]。

國內目前已有多家單位在開展加米霉素的仿制研究[4-6]，由于加米霉素的質量標準并未收載于國內外獸藥典或各類質量標準匯編，因此在加米霉素及其注射液的仿制過程中，需要建立其質量控制方法。筆者建立了高效液相色譜法測定加米霉素的含量，為其質量控制提供依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。加米霉素原料，批號20140901、20140902、20140903，由洛陽惠中獸藥有限公司生產。加米霉素對照品，含量98.8%，批號HZD140801;6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素對照品，含量95.0%，批號20170724，均由洛陽惠中獸藥有限公司制備。

1.1.2主要儀器。高效液相色譜系統（Waters e2695型HPLC;2489型紫外檢測器;Empower 2色譜工作站軟件），美國Waters公司;XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），美國Waters公司;AB265-S電子分析天平，梅特勒托利多公司;Seven easy型酸度計，梅特勒托利多公司。

1.1.3主要試劑。磷酸氫二鉀、磷酸為分析純;乙腈為色譜純;水為超純水。

1.2方法

1.2.1系統適用性溶液的制備。稱取加米霉素與6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素對照品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL中約含加米霉素1 mg與6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素0.5 mg的混合溶液，即得。

1.2.2對照品溶液的制備。稱取加米霉素對照適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL中約含加米霉素1 mg的溶液，即得。

1.2.3供試品溶液的制備。稱取供試品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL中約含加米霉素1 mg的溶液，即得。

1.2.4色譜條件。色譜柱為Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相為磷酸鹽緩沖液（取0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液，用稀磷酸調節pH至8.0）-乙腈（30∶70）;流速為1.0 mL/min;檢測波長為205 nm;柱溫為30 ℃。

1.2.5方法學考察。

1.2.5.1系統適用性試驗。分別精密吸取空白溶劑、系統適用性溶液、對照品溶液和供試品溶液20 μL，在“1.2.4”色譜條件下，注入高效液相色譜儀進行測定，記錄色譜圖，考察系統適用性。

1.2.5.2線性關系考察。精密稱取加米霉素對照品，加流動相溶解制成濃度為4.984 0 mg/mL的溶液，作為對照品儲備液。精密吸取儲備液1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為不同濃度的對照品溶液。精密吸取上述系列濃度的對照品溶液各20 μL，從低濃度到高濃度依次進樣分析，記錄色譜圖，以濃度（mg/mL）為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算線性回歸方程。

1.2.5.3進樣精密度試驗。取按“1.2.2”方法制備的對照品溶液，精密吸取20 μL，在“1.2.4”色譜條件下，注入高效液相色譜儀進行測定，連續進樣6次，計算峰面積的RSD。

1.2.5.4重復性試驗。取同一批號的供試品（批號20140901），按“1.2.3”方法平行制備6份供試品溶液，精密吸取20 μL，在“1.2.4”色譜條件下，注入高效液相色譜儀進行測定，計算平均含量和RSD。

1.2.5.5中間精密度試驗。取同一批號的供試品（批號20140901），按“1.2.3”方法制備6份供試品溶液，在不同日期由不同人員在不同的高效液相色譜儀上，按“1.2.4”色譜條件進行測定，計算平均含量和RSD。

1.2.5.6穩定性試驗。取同一份供試品溶液，按“1.2.4”色譜條件分別于0、2、4、6、8、12 h進樣，測定峰面積，計算RSD。

1.2.5.7回收率試驗。取同一批號的供試品（批號20140901）約10 mg，精密稱定，置20 mL容量瓶中，分別按照測定濃度的80%、100%、120% 3個水平添加加米霉素對照品，按“1.2.3”方法制備供試品溶液，每個濃度水平平行制備3份，按“1.2.4”色譜條件測定，計算平均回收率和RSD。

1.2.6樣品測定。取3批供試品，按“1.2.3”方法制備供試品溶液并測定，計算加米霉素的含量。

2結果與分析

2.1方法學考察

2.1.1系統適用性試驗。圖1表明，在“1.2.4”色譜條件下，加米霉素與6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素的分離度符合要求，空白溶劑在加米霉素對照品相應的保留時間處無干擾。

2.1.2線性關系考察。按“1.2.5.2”方法操作，以濃度（mg/mL）為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線如圖2所示，計算得出線性回歸方程為y=2.64×106x+26 344（r=0.999 9），表明加米霉素濃度在0.498 4～1.993 6 mg/mL與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.3進樣精密度試驗。按“1.2.5.3”方法操作，計算得出峰面積的RSD為0.3%，表明儀器精密度良好。

2.1.4重復性試驗。按“1.2.5.4”方法操作，計算得出平均含量為99.8%，RSD為0.1%，表明該方法重復性良好。

2.1.5中間精密度試驗。按“1.2.5.5”方法操作，計算得出平均含量為99.8%，RSD為0.1%，表明該方法中間精密度良好。

2.1.6穩定性試驗。按“1.2.5.6”方法操作，計算峰面積的RSD為1.2%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.1.7回收率試驗。由表1可見，平均回收率為99.2%，RSD為0.6%，表明該方法準確度良好。

2.2樣品測定按“1.2.6”方法操作，計算得出3批樣品中加米霉素含量分別為99.8%、99.7%和99.6%。

3討論

3.1色譜條件的選擇加米霉素結構與阿奇霉素、泰拉霉素類似，均屬于十五元大環內酯類抗生素，因此在其含量測定方法的建立過程中，參考并比較了《獸藥質量標準匯編（2006—2011年）》[7]泰拉霉素含量測定色譜條件（KH2PO4-甲醇-乙腈系統）及《歐洲藥典》8.0[8]和《中國藥典》2010年版[9]阿奇霉素含量測定色譜條件（K2HPO4-乙腈系統），最終以《中國藥典》2010年版[9]阿奇霉素含量測定色譜條件為基礎，以加米霉素峰的保留時間和分離度為指標，通過對K2HPO4溶液的pH及其與乙腈的比例進行優化，確定了加米霉素的含量測定條件。

3.2系統適用性考察方法的確定加米霉素為紅霉素A肟（E型）經異構化反應，再經重排、還原、丙基化反應制備生成[10]。由于紅霉素A肟（E型）在相同反應條件下經重排、還原、丙基化可生成6-N-丙基-N去甲基阿奇霉素，其結構與加米霉素的差別僅在于十五元環上N位置的不同，2種產物結構相似，易于混淆。高效液相色譜法可以通過保留時間的不同對兩者進行鑒別，但對色譜條件要求較高，否則兩者不能良好分離導致色譜峰重疊，因此在系統適用性考察中規定6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素和加米霉素的分離度應符合要求，以求可以有效鑒別并測定加米霉素含量。

3.3耐用性試驗分別考察柱溫±5 ℃、流速±0.2 mL/min、流動相比例±2%、磷酸鹽緩沖液pH±0.2及色譜柱型號的變化對含量測定的影響，以系統適用性及加米霉素含量為考察指標，考察色譜條件的耐用性。結果表明，柱溫、流速、流動相比例、流動相pH發生微小變化時，系統適用性均符合要求，對含量測定結果的影響較小;對色譜柱的型號進行了考察，分別使用Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Waters XTerra C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）進行系統適用性考察，使用Waters XTerra C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）時加米霉素峰與6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素峰完全重疊，而使用Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）時，系統適用性考察分離度大于1.5，因此方法規定采用Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

4結論

該研究建立了高效液相色譜法測定加米霉素的含量，該方法可對加米霉素及其異構體6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素進行有效的鑒別，方法學考察表明該方法專屬性、精密度、重復性良好，可準確測定加米霉素的含量，為其質量控制了良好的方法。

47卷3期張 聰等加米霉素含量測定方法的建立

參考文獻

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