木薯苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及其對低溫脅迫的響應

吳遠航 劉秦 劉攀道 郭鵬飛 李敏 蔣凌雁

摘? 要? 本研究從全基因組水平對木薯（Manihot esculenta Crantz）苯丙氨酸解氨酶編碼基因（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）進行鑒定，并以木薯品種KU50為材料克隆了6個PAL基因，分析了低溫脅迫（7 ℃）對葉片MePAL表達模式、PAL酶活性、總酚含量、類黃酮含量和總抗氧化能力的影響。結(jié)果表明：低溫處理使木薯葉片迅速萎蔫卷曲，并伴隨葉片PAL酶活性、總酚含量、類黃酮含量和總抗氧化能力的顯著提高。Real-time PCR分析表明，在低溫處理前，MePAL1和MePAL2的相對表達量分別為0.83和1.19，顯著高于其他4個MePAL基因，低溫處理后6個MePAL基因均不同程度受低溫脅迫誘導增強表達，其中MePAL5上調(diào)最高，達50.5～142.5倍。本研究結(jié)果初步顯示低溫脅迫上調(diào)了木薯葉片MePAL的表達，促進了總酚和類黃酮的合成，提高了抗氧化損傷的能力。

關(guān)鍵詞? 木薯;低溫脅迫;苯丙氨酸解氨酶基因;類黃酮;抗氧化

中圖分類號? S533? ? ?文獻標識碼? A

木薯（Manihot esculenta Crantz）作為一種主要收獲塊根的經(jīng)濟作物，是熱帶地區(qū)重要的糧食來源和生物能源原材料[1]。木薯抗旱、耐瘠薄、適應性強，在我國南方被大量種植。但木薯是典型的熱帶作物，低溫是限制其種植區(qū)域和產(chǎn)量的重要因素[2]。在低溫環(huán)境下，木薯細胞膜結(jié)構(gòu)破壞，胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，毒性物質(zhì)積累，活性氧產(chǎn)生，葉片光合作用受阻，植株生長發(fā)育延緩，甚至死亡。

苯丙烷代謝途徑是植物緩解逆境脅迫的一條重要次生代謝途徑[3-4]。該途徑以L-苯丙氨酸或者酪氨酸為底物，通過系列酶促反應，可產(chǎn)生大量的苯丙烷類化合物，包括多酚、香豆素、類黃酮/花青素和大分子木質(zhì)素等多種化合物[5-6]。研究表明酚類、類黃酮等物質(zhì)可以作為抗氧化劑，清除逆境脅迫下產(chǎn)生的大量活性氧和自由基，從而降低逆境脅迫下植物所受的氧化損傷[7]。低溫逆境下，玉米可以通過調(diào)節(jié)花青素合成通路的相關(guān)基因，提高花青素的含量，增強對低溫的耐受[8]。大豆在低溫馴化過程中，多種苯丙烷代謝產(chǎn)物（對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、茴香酸、對香豆酸和阿魏酸）的相對含量顯著提高，這些酚酸被認為可改變細胞壁的物理特性，提高大豆對低溫的適應能力[9]。宋靜武等[10]研究了低溫脅迫下核桃（Juglans regia）葉片多酚黃酮類成分，發(fā)現(xiàn)這類物質(zhì)的含量與低溫脅迫響應有較強的相關(guān)性。董春娟等[11]研究了黃瓜（Citrullus lanatus）幼苗的抗寒性，發(fā)現(xiàn)苯丙烷類次生代謝產(chǎn)物合成的增多可以提高細胞內(nèi)抗氧化酶的活性，保持抗壞血酸（AsA）的還原性，緩解低溫脅迫以及葉片的光損傷和氧化損傷。

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase， PAL）催化L-苯丙氨酸形成肉桂酸，是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶[12]。其活性同植物體內(nèi)酚類、類黃酮等各種次生代謝產(chǎn)物的合成有著密切關(guān)系[13]。PAL在轉(zhuǎn)錄水平上受到多種脅迫信號的調(diào)節(jié)，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）葉片中的AtPAL1和AtPAL2在低溫條件下表達上調(diào)[14]。植物遭受機械傷害、干旱、高溫等逆境脅迫研究時，均可檢測到部分PAL的上調(diào)表達[15-17]。作為已完成基因組測序的重要熱帶農(nóng)作物，木薯PAL信息知之甚少。本文研究了低溫脅迫下MePAL的表達模式、PAL酶活性、類黃酮含量、總酚含量和總抗氧化能力的變化，旨在解析MePAL介導的苯丙烷代謝途徑對低溫脅迫的響應模式，為木薯耐低溫品種選育和栽培提供理論基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試木薯品種為KU50（Kasetsart University 50），種莖來源于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所，盆栽于海南大學熱帶農(nóng)林學院實驗基地。

1.2? 材料的低溫脅迫處理

盆栽45 d后，選取健康、長勢基本一致的木薯苗，置人工氣候培養(yǎng)箱，在溫度25 ℃，光培養(yǎng)16 h，暗培養(yǎng)8 h的條件下“均一化”處理3天。然后降溫至7 ℃進行脅迫處理，在0、9、24 h取木薯苗的第一片和第二片完全展開的功能葉（從上往下數(shù)），每個時間點設(shè)3個生物學重復，取樣后放入液氮中速凍，貯存于80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.3? 相關(guān)生理指標的測定

1.3.1? PAL活力測定? ?測定原理：PAL催化L-苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸和氨，反式肉桂酸在290 nm處有最大吸收值，通過測定吸光值變化計算PAL活性。具體步驟參照苯丙氨酸解氨酶（PAL）測試盒（購于南京建成生物工程研究所，貨號：A137）的說明書。

1.3.2? 類黃酮（Flavonoid）含量測定? 測定原理：在堿性亞硝酸鹽溶液中，類黃酮與鋁離子形成在502 nm處有特征吸收峰的紅色絡(luò)合物，通過測定樣品提取液在502 nm處的吸光值計算類黃酮的含量。具體步驟參照植物類黃酮檢測試劑盒（購于南京建成生物工程研究所，貨號：A142）的說明書。

1.3.3? 總酚（Total phenol）含量測定? 具體步驟參照植物總酚檢測試劑盒（購于南京建成生物工程研究所，貨號：A143）的說明書。

1.3.4? 總抗氧化能力（T-AOC）測定? 測定原理：機體中有很多抗氧化物質(zhì)，能使Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物，該絡(luò)合物在520 nm處特征吸收峰，通過測定520 nm處的吸光值可以計算出抗氧化能力。具體步驟參照總抗氧化能力測定試劑盒（購于南京建成生物工程研究所，貨號：A015）的說明書。

1.4? RNA提取及cDNA合成

稱取葉片樣品0.1 g，用液氮研磨成粉末，按照RNAplant Plus植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）的說明書，提取木薯總RNA，使用超微量分光光度計NanoDrop 2000檢測總RNA的濃度和純度。參照Primescript RT Reagent Kit gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）的說明書合成cDNA，保存于20 ℃。

1.5? 生物信息學分析

利用木薯基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www. phytozo

me.net/cassava）獲得木薯PAL的所有序列;利用Protparam在線工具（https：//web.expasy.org/ protp

aram/）進行蛋白理化性質(zhì)分析;利用GSDS在線工具（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）進行基因結(jié)構(gòu)分析;利用MEGA 7軟件建立系統(tǒng)進化樹。

1.6? 基因的克隆及Real-time PCR分析

利用Oligo 7軟件設(shè)計基因全長引物及定量

引物（表1），并由天一輝遠基因科技有限公司合成。利用全長引物，以上述合成的cDNA為模板，使用高保真聚合酶Phusion（Thermo）擴增MePAL的全長序列。

以木薯內(nèi)參基因ef1α為參照[18]，使用實時熒光定量PCR（Real-time PCR）技術(shù)分析基因的相對表達量。試劑盒為SYBR? Premix Ex Taq? II （Tli RNaseH Plus），購于TaKaRa公司。使用的儀器為Rotor-Gene Q（QIAGEN），采用雙標準曲線法計算相對表達量。

1.7? 數(shù)據(jù)分析

本研究的相關(guān)數(shù)據(jù)有3次生物學重復，使用 Microsoft office 2007軟件進行分析并繪制圖表，使用IBM SPSS Statistics 20軟件進行獨立樣本T檢驗來分析差異的顯著性。

2? 結(jié)果與分析

2.1? MePAL的生物信息學分析

在木薯基因組數(shù)據(jù)庫中用BLAST搜索4個擬南芥PAL的同源氨基酸序列，獲得6個木薯PAL及其候選基因（MePAL），按所在染色體上的順序?qū)ζ湟来蚊麨镸ePAL1-MePAL6。6個MePAL分別分布在木薯的4、7、8、9、10和16號染色體上;6個推測的PAL蛋白的等電點介于5.90～

6.31 pI之間，均為酸性蛋白;分子量介于76.97～ 78.16 ku之間（表2）。

為了比較木薯PAL之間的相似性，將推測的6個木薯PAL的氨基酸序列進行對比（圖1A）;并利用MEGA 7軟件使用Neighbor-Joining算法，bootstrap值為1000，對氨基酸序列繪制了進化樹（圖1B）;同時利用GSDS在線工具繪制了基因結(jié)構(gòu)圖（圖1C）。從進化樹來看，MePAL2與MePAL5，MePAL3與MePAL4之間的同源性較高，MePAL6與其他5個MePAL同源性較低，被分在2個不同的分支;從基因結(jié)構(gòu)來看，MePAL1-5都有2個外顯子和1個內(nèi)含子，而MePAL6與MePAL1-5不同，只有1個外顯子，沒有內(nèi)含子。

2.2? MePAL編碼基因的克隆

根據(jù)6個MePAL基因的序列，設(shè)計全長引物（表1），以cDNA為模板，進行RT-PCR反應，擴增得到6條2100 bp左右的片段，與目標大小一致，如圖2所示。

2.4? 低溫脅迫下木薯葉片PAL活性、總酚含量、類黃酮含量和總抗氧化能力變化

由圖4所示，低溫處理使木薯葉片PAL酶活性顯著增加，7 ℃處理9 h和24 h后木薯葉片PAL酶活性分別為處理前（0 h）的1.68倍和1.72倍。低溫處理還導致木薯葉片的總酚含量和類黃酮含量分別提高47.66%～55.75 %和41.97%～50.65 %，同時，總抗氧化能力也提高了1.03～2.82倍。

2.5? MePALs受低溫脅迫誘導

在低溫脅迫下的表達模式，結(jié)果表明，低溫處理9 h和24 h使MePAL3、MePAL4、MePAL5和MePAL6的表達水平顯著提高，其中，MePAL5上調(diào)倍數(shù)最多，在低溫處理9 h和24 h后的表達量分別為處理前（0 h）的142.5倍和50.5倍。此外，雖然MePAL1的表達量在低溫處理9 h后無顯著增加，但處理24 h后上調(diào)。而MePAL2僅在低溫處理9 h后顯著上調(diào)表達。

3? 討論

總酚和類黃酮是植物中重要的次生代謝物質(zhì)，同植物的逆境響應有著密切的關(guān)系。Pennycooke等[19]發(fā)現(xiàn)低溫處理矮牽牛花（Petunia hybrida）提高了總酚含量和總抗氧化能力。此外對擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，在低溫，干旱，高鹽條件下，類黃酮合成被促進[20]。本研究中，木薯在低溫脅迫處理9 h和24 h后，葉片的總酚含量與類黃酮含量相對于0 h均顯著提高，總抗氧化能力也顯著提高，暗示總酚和類黃酮參與了木薯對低溫冷害的響應。這些物質(zhì)可以作為一類供氫型自由基清除劑[21]，來降低活性氧和自由基對植物的傷害。PAL作為苯丙烷代謝途徑的第一個酶，其活性同植物體內(nèi)多酚和類黃酮的總含量呈正相?關(guān)，因此PAL活性可以作為植物抗逆境能力的一個生理指標[22]。低溫處理后，木薯的PAL活性得到顯著提高，暗示PAL可能通過調(diào)節(jié)多酚和類黃酮合成，進而參與木薯對低溫脅迫的響應。

隨著大量的植物基因組序列公布，多種植物的PAL編碼基因家族已被鑒定，在所有已研究的物種上，PAL被證明是一個多拷貝基因家族。雖然這些PAL基因序列的編碼區(qū)在不同物種中差異較小，但是家族基因數(shù)量變化較大，如擬南芥中只有4個PAL基因[23]，西瓜（Citrullus lanatus）中有12個PAL基因[24]，而馬鈴薯（Solanum tuberosum）中則至少有40個PAL基因[25]。本研究從全基因組水平對木薯PAL編碼基因進行了生物信息學分析，共鑒定并克隆了6個MePAL。進化樹結(jié)果分析表明，MePAL2和MePAL5，MePAL3和MePAL4互為旁系同源基因，表明在木薯PAL基因在進化過程中經(jīng)歷過基因復制事件。木薯的PAL基因多為2個外顯子，1個內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，這與已報道的其它物種的PAL基因結(jié)構(gòu)較為一致。但MePAL6只有一個外顯子，表明該基因在進化過程中丟失了內(nèi)含子。

PAL基因的表達除了受組織特異性和發(fā)育時期的影響之外，還受不同環(huán)境條件的調(diào)控。對黃瓜的研究表明，低溫誘導了幼苗中PAL基因的表達，并顯著提高其酶活性[11]。類似地，紅葉芥（Brassica Juncea）PAL的基因表達水平和酶活性在低溫脅迫18 h后迅速升高[26]。本研究中，低溫脅迫使木薯葉片6個MePAL的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生不同程度的上調(diào)，同時使PAL酶活性顯著增加，表明MePAL基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)與PAL酶活性升高有關(guān)。旁系同源基因MePAL2與MePAL5，MePAL3與MePAL4在表達量高低、變化趨勢上的表現(xiàn)較為一致，暗示它們在受低溫脅迫時可能存在功能協(xié)同，與擬南芥、西瓜、黃瓜、葡萄（Vitis vinifera）和番茄（Lycopersicon esculentum）等的情況相似[27-28]。

綜上所述，木薯在低溫脅迫下通過上調(diào)葉片MePAL基因的表達水平和PAL酶活性，促進苯丙烷代謝途徑下游代謝產(chǎn)物（總酚和類黃酮）的合成，從而提高木薯葉片總抗氧化能力和低溫逆境的適應性。

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