青天葵獨腳金內酯信號轉導關鍵基因D14的克隆與亞細胞定位分析

李炎坤 卓一南 曾湘達 何瑞

摘? 要? D14基因是獨腳金內酯信號轉導途徑的關鍵基因，其編碼的蛋白能夠使SLs釋放出活性小分子物質而發揮調節腋芽起始的功能。本研究根據其他物種的D14基因從青天葵轉錄組數據中篩選獲得2條高度同源的片段，命名為NfD14a和NfD14b。應用RT-PCR和RACE技術，克隆獲得NfD14a和NfD14b的cDNA全長序列，GenBank登錄號分別為MH028026、MH028027。NfD14a基因全長1206 bp，ORF為861 bp，編碼286個氨基酸;NfD14b基因全長1082 bp，ORF為813 bp，編碼270個氨基酸。對NfD14的編碼蛋白序列進行了生物信息學分析，結果表明：NfD14a和NfD14b均屬于a/b折疊蛋白水解酶超家族成員（Abhydrolase superfamily），但系統進化分析結果表明兩者同源性不高。利用一步快速克隆的方法構建了植物表達載體35S：：NfD14a-EGFP和35S：：NfD14b-EGFP，并分別獲得其工程菌。瞬時表達結果表明，NfD14a和NfD14b均定位在煙草原生質體的細胞核和細胞質。本研究通過對NfD14基因全長cDNA序列的克隆與亞細胞定位分析，為青天葵獨腳金內酯信號轉導途徑調控植物分枝生長發育機制的研究奠定基礎。

關鍵詞? 青天葵;獨腳金內酯;D14;RACE克隆中圖分類號? S567? ? ? 文獻標識碼? A

嶺南藥材青天葵來源于蘭科植物毛唇芋蘭[Nervilia fordii （Hance） Schltr.]的干燥葉或全草，主要分布于兩廣、海南、四川、云南等地區。青天葵具有清熱潤肺、解毒消腫的功效，主治肺癆咳血、肺熱咳嗽、口瘡、喉嚨腫痛等[1]呼吸道疾病，代表性中成藥有天龍咳喘靈膠囊、天龍茶、天龍喘咳靈等[2-3]，具有較高的經濟價值。然而青天葵自身繁殖能力低，臨床需求量大，過度采挖造成青天葵野生資源嚴重枯竭。雖然研究人員已經對青天葵展開了多方面的研究[4-6]，但對于解決青天葵藥用資源短缺的問題收效甚微。

近年來，研究人員從植物的多分枝突變體中發現了一類新型植物激素——獨腳金內酯（Stri golactones，SLs），具有抑制植物分枝生長、控制中胚軸伸長、促進側根形成和誘導根毛伸長的作用[7-8]。目前已經被證實參與獨腳金內酯的合成和運輸途徑的關鍵基因有D27、CCD7、CCD8、MAX1、D3、D53和D14等[9-10]。其中D14基因是獨腳金內酯運輸途徑中的關鍵基因，能夠與D3蛋白形成SCF蛋白復合體，與SLs結合釋放出活性小分子物質CLIM（covalently linked inter mediate mole cule），從而發揮SLs的生理活性，同時促進D53被26S降解，抑制植物的分枝[11]。另外，研究人員從水稻中克隆得到了參與到獨腳金內酯信號轉導的3個D14基因，包括DWARF2、D88和HTD2，發現這些基因都參與控制水稻的分蘗[11];在擬南芥中，研究發現CLIM與受體AtD14的催化中心以共價鍵結合，進而激活SLs的信號轉導，揭示了“底物-酶-活性分子-受體”的新機制[12-15]。矮牽牛中克隆得到D14的同源基因DAD2，在酵母雙雜交實驗中，在GR24存在的條件下，可以與PhMAX2A相互作用啟動SCF介導的信號傳導途徑，而且其構象發生變化;同時，DAD2可以水解GR24，但水解產物不能促進蛋白間的相互作用，對植物的分枝不起調控作用，暗示DAD2在獨腳金內酯通路中可能不起水解酶的作用[16]。除此之外，D14基因還參與了植物的其他應激反應。有文獻報道，水稻OsD14基因在正常條件下是被抑制表達從而促進其分蘗，但是受到寒冷脅迫后，OsMADS57與OsWRKY94結合并激活OsD14的轉錄，促進OsD14基因的表達而抑制其分蘗[17]。

青天葵每株僅一個塊莖及一片葉子，產量極低，具分枝的青天葵植株極為罕見。開展青天葵中獨腳金內酯信號轉導途徑中D14基因的相關研究，有助于了解獨腳金內酯信號轉導途徑在青天葵中對側枝生長發育的影響，可為今后深入研究NfD14的蛋白結構與功能等奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物材料? 本研究所用植物材料青天葵為廣西壯族自治區中醫藥研究院中藥資源研究所黃云峰老師采集并鑒定，確認其為蘭科植物毛唇芋蘭[Nervilia fordii （ Hance） Schltr.]，于廣州中醫藥大學中藥資源科學與工程研究中心實驗室培育。煙草NC89種子為華南植物園潘麗珠老師饋贈，采用土培直播法培育2個月后采集葉片用于亞細胞定位實驗。

1.1.2? 菌株與質粒? 大腸桿菌（Escherichia coli）菌株E. coli Top10感受態細胞和pLB Vector均購自天根生化科技（北京）有限公司。農桿菌菌株EHA105感受態細胞購自廣州市春泥生物科技有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 青天葵NfD14基因的篩選? 從NCBI下載得到水稻和擬南芥的D14同源基因堿基序列，與課題組前期建立的青天葵轉錄組注釋的Unigenes數據庫進行比對，篩選得到高度同源的Unigenes-NfD14片段。

1.2.2? 葉片總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成? 參照梁凌玲等[18]優化的RNA提取方法（改良RNAiso Plus法）提取青天葵葉片總RNA，用微量分光光度計測定其濃度和純度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，于-80 ℃保存備用。參照PrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa）說明書合成cDNA第一鏈，利用18S rRNA驗證cDNA的完整性。

1.2.3? 青天葵NfD14基因核心片段的克隆? 以Unigenes-NfD14基因為模板，用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物a-F和a-R、b-F和b-R（見表1）。以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為10 μL：2×PCR Buffer for KOD FX（TOYOBO公司）5 μL，dNTPs（2 mmol/L） 2.5 μL，上游引物和下游引物（10 μmol/L）各0.25 μL，模板cDNA 0.25 μL，KOD FX（200 μL）0.25 μL，ddH2O 1. 5 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性180 s;然后進行35個循環反應，循環反應為94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s;最后72 ℃再延伸300 s，4 ℃保存。PCR產物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認目的片段后，按比例擴大體積至50 μL進行PCR擴增，用通用型DNA純化回收試劑盒（天根）回收目的片段。參照pLB零背景克隆試劑盒（天根）說明書，將目的片段連接到pLB Vector并轉化Top10感受態細胞，進行菌液PCR驗證和DNA測序。DNA測序由廣州天一輝遠基因科技有限公司完成。

1.2.4? 5?與3?端序列RACE克隆? 以Unige nes NfD14序列為模板，分別設計5?端和3?端特異性巢式PCR引物，5?端特異性巢式引物5?a-1F和5?a-2F、5?b-1F和5?b-2F，3?端特異性巢式引物3?a-1F和3?a-2F、3?b-1F和3?b-2F（表1）。按照Ta K aRa公司的SMARTer RACE 5?/3?Kit User Manual說明書擴增得到5?-RACE和3?-RACE的cDNA第一鏈。分別以5?-RACE和3?-RACE的cDNA第一鏈為模板，擴增D14基因的5?端和3?端序列。PCR反應體系和條件參見1.2.3節，退火溫度為55 ℃。將目的片段進行回收、連接、轉化和鑒定后，挑取陽性菌株送廣州天一輝遠基因科技有限公司進行測序。

1.2.5? NfD14基因的開放閱讀框的擴增? 用DNAMAN軟件拼接NfD14基因的cDNA全長序列，再用SnapGene軟件預測其開放閱讀框（ORF），設計特異性引物aORF-F和aORF-R、bORF-F和bORF-R（表1），以cDNA為模板，擴增NfD14基因的編碼區序列。PCR反應體系和條件參見1.2.3節，退火溫度為60 ℃。PCR擴增產物回收、菌液PCR驗證和測序參見1.2.3節。編碼區序列測序結果與拼接全長序列進行比對，糾正拼接序列個別錯誤堿基，獲得NfD14基因的編碼區序列。

1.3? NfD14基因的生物信息學分析

采用ProtParam（http：//web.expasy.org/protpar am/）在線工具計算目的基因所編碼蛋白的分子量、等電點、總平均疏水指數（GRAVY）、脂肪系數（AI）、穩定性系數等理化性質。用Phyre2 （http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）預測蛋白質的三級結構。采用WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）對編碼蛋白進行亞細胞定位預測。用SignalP 4.1 Server在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行信號肽預測。利用NCBI的BLASTP和Smart BLAST對氨基酸序列進行同源檢索和功能域在線預測，并用DNAMAN進行多重序列比對，再用MEGA 5.10構建系統進化樹。

1.4? 植物表達載體的構建及亞細胞定位

根據諾唯贊ClonExpressⅡ One Step Cloning Kit說明書構建植物表達載體，以含有NfD14a和NfD14b的完整編碼區序列質粒，以及由陳秀珍等[19]構建含有EGFP片段的pRI101-EGFP質粒為模板，設計特異性引物pa-F和pa-R、pb-F和pb-R、EGFP-F和EGFP-R（表1）擴增NfD14a和NfD14b的完整編碼區序列，以及EGFP片段。PCR反應體系和條件參見1.2.3節，退火溫度為60 ℃。然后參照試劑盒說明書，將獲得的目的片段與用SalⅠ和EcoRⅠ酶切后的pRI101-AN DNA質粒（TaKaRa公司）片段連接轉化后，獲得35S：：NfD 14a-EGFP、35S：：NfD14b-EGFP和35S：：EGFP質粒。利用凍融法將重組質粒轉入根瘤農桿菌EHA105中，用載體通用引物35S和RV（表1）進行菌液PCR驗證為陽性菌株后，用注射法將其導入煙草葉片中瞬時表達[20]。提取煙草葉片原生質體后，使用LSM800型激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss）觀察攜帶綠色熒光蛋白標記的目標蛋白的表達情況及其亞細胞定位特征。

2? 結果與分析

2.1? 青天葵NfD14基因的篩選

通過與水稻（Oryza sativa）和擬南芥（Arabido psis thaliana）的OsD14/AtD14比對，從青天葵的轉錄組數據中篩選到2條高度同源的Unigenes- NfD14，命名為NfD14a和NfD14b。

2.2? 葉片總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成

用改良RNAiso Plus法提取青天葵葉片總RNA，微量分光光度計檢測顯示L1、L2、L3和L4總RNA樣品的OD260/OD280均在1.9～2.0，OD260/OD230均在1.7～1.9范圍，說明RNA的純度高，未被污染。1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，28S rRNA和18S rRNA條帶明亮清晰（圖1），可見所獲得的青天葵葉片總RNA完整性較好，可用于RT-PCR擴增實驗。以反轉錄后獲得的cDNA為模板，18S-F和18S-R為引物進行PCR擴增，得到約500 bp的清晰明亮條帶（圖1），說明cDNA的質量較好，可以用于后續實驗。

2.3? 青天葵NfD14基因的克隆

通過設計特異性引物擴增得到752 bp的NfD14a核心片段，RACE擴增獲得857 bp的5?端序列和964 bp的3?端序列（圖2）。另外，獲得365 bp的NfD14b核心片段，RACE擴增獲得422 bp的5?端序列和1029 bp的3?端序列。將核心片段、3?端序列和5?端序列進行拼接，分別得到NfD14a和NfD14b的cDNA全長序列為1206 bp、1082 bp（圖2）。采用SnapGene軟件分析2條基因的全長序列，分別獲得其開放閱讀框（ORF）、3?非編碼區（3?UTR）、5?非編碼區（5?UTR）（表2）。將NfD14a和NfD14b的基因序列提交GenBank數據庫，登錄號分別為MH028026、MH028027。

2.4? 青天葵NfD14的生物信息學分析

2.4.1? NfD14蛋白的基本理化性質? ProtParam在線軟件分析結果表明，NfD14a蛋白的分子量為31.16 ku，等電點為6.19，原子總數為4397，穩定性系數為39.81，屬于穩定蛋白（穩定系數<40為穩定蛋白，>40為不穩定蛋白），脂肪系數（AI）

為104.97，總平均親水性（GRAVY）為0.181，說明NfD14a屬于疏水蛋白。NfD14b蛋白的分子量大小為30.02 ku，等電點為4.94，原子總數為4226，穩定性系數為38.89，屬于穩定蛋白，AI為106.78，GRAVY為0.215，表明NfD14b屬于疏水蛋白。

2.4.2? NfD14蛋白的保守功能域、三級結構、亞細胞定位和信號肽預測? 將NfD14a和NfD14b蛋白提交到NCBI，用BLASTP在數據庫中進行蛋白保守功能域分析，結果表明，NfD14a蛋白在第29個到第286個氨基酸序列、NfD14b蛋白在第11個到第265個氨基酸之間的序列均包含水解酶超家族（Abhydrolase superfamily）的保守功能域（圖3A，圖3B）;再進行Smart BLAST，結果顯示NfD14a和NfD14b均與水解酶相似性高。使用Phyre2在線軟件預測NfD14蛋白的三級結構，結果表明，NfD14a的PDB頭部為水解酶，屬于A鏈，與dad2 s96a突變體的晶體結構相似度達91%;NfD14b的PDB頭部也是水解酶，屬于A鏈，α/β折疊蛋白質家族，與擬南芥D14蛋白的晶體結構相似度達99%（圖3C，圖3D）。利用WoLF PSORT在線軟件對NfD14蛋白的亞細胞定位進行預測可知，NfD14a蛋白定位的分布大小依次為葉綠體>細胞核=液泡>細胞質，而NfD14b蛋白定位的分布大小依次為細胞質>細胞核>葉綠體=類囊體。根據SignalP 4.1 Server在線軟件預測可知，NfD14a和NfD14b蛋白的信號肽平均值分別為0.101、0.108，均小于0.500，因此推測NfD14a和NfD14b蛋白無信號肽及切割位點，屬于非分泌蛋白，在細胞質中合成后不能被轉運到細胞外（圖3E，圖3F）。

2.4.3? NfD14蛋白的進化樹分析? 從NCBI上篩選出與NfD14氨基酸序列相似度較高的其他物種的D14蛋白序列，并將其與青天葵NfD14基因預測的氨基酸序列進行多重序列比對。結果顯示，NfD14蛋白氨基酸序列與其他物種的D14氨基酸序列有較高的保守性（圖4）。使用MEGA 5.10構建的系統進化樹顯示，NfD14b為單獨一個分支;而NfD14a與鐵皮石斛聚為一支，表明其與鐵皮石斛的D14氨基酸序列同源性較高，其次與水稻和甘蔗的親緣關系較近，說明同為單子葉植物的D14基因的親緣性較高（圖5）。但是NfD14a和NfD14b與深圳擬蘭D14的同源性不高，可見青天葵與同為蘭科植物的鐵皮石斛的親緣關系近，而與深圳擬蘭的親緣關系較遠。

2.5? 植物表達載體的構建及亞細胞定位

為了研究NfD14的功能，用一步快速克隆的方法成功將NfD14的ORF序列與EGFP共同構建到植物表達載體pRI101-AN DNA中，獲得了

水稻OsD14，登錄號：Q10QA5.1;菊花DgD14，登錄號：AJD87462.1;擬南芥AtD14，登錄號：Q9SQR3.1;大豆GmD14，登錄號AQY54418.1;鐵皮石斛DcD14，登錄號：PKU86591.1;深圳擬蘭AsD14，登錄號：PKA57698.1;煙草NtD14，登錄號：OIT40479.1;草原水綿SpD14，登錄號：AFI78791.1;軟克里藻KfD14，登錄號：AFI78790.1;甘蔗ScHTD2，登錄號：AJY78078.1;矮牽牛PhDAD2，登錄號：AFR68698.1;豌豆PsRMS3，登錄號：AMB61030.1。

35S：：NfD14a-EGFP，35S：：NfD14b-EGFP質粒。測序結果正確無誤后，用凍融法轉化農桿菌EHA 105，分別獲得其工程菌（以轉入空載35S：：EGFP的農桿菌作為對照），菌液PCR結果顯示分別擴增獲得2107 bp和2059 bp的片段產物，說明含有NfD14a-EGFP和NfD14a-EGFP基因片段的載體質粒成功轉入到了農桿菌EHA105。將獲得的工程菌培養后進行煙草葉片下表皮注射并培養4～6 d，提取煙草葉片原生質體觀察蛋白的定位情況。結果顯示，在瞬時表達35S：：NfD14a-EGFP，35S：： NfD14b-EGFP的原生質體的細胞核和細胞質中均觀察到綠色熒光，說明NfD14定位在細胞核和細胞質中。

3? 討論

獨腳金內酯（SLs）作為一種新型植物激素而成為了人們的研究熱點。雖然獨腳金內酯的生物合成途徑、生理學功能、信號轉導途徑、分離純化和結構鑒定等已逐漸被了解，但是有關SLs的生物合成和信號轉導途徑仍有待進一步闡明。本研究著重探討青天葵中獨腳金內酯信號轉導途徑中的關鍵基因NfD14，利用RT-PCR和RACE技術，獲得NfD14a和NfD14b基因的cDNA全長序列。經生物信息學分析，獲得了NfD14a和NfD14b的基本理化信息。系統進化分析發現NfD14a和NfD14b并未在進化樹上聚為一支，提示這兩條基因的功能上可能有差異，還需進一步研究。其中NfD14a與水稻、甘蔗的親緣關系較近，可能具有OsD14和ScHTD2參與獨腳金內酯信號轉導的類似功能，后續將進行擬南芥的遺傳轉化實驗，將對該推斷進一步實驗驗證。另外，在線軟件預測NfD14a主要定位于葉綠體而NfD14b主要定位于細胞質中，提示NfD14可能參與調控植物的光合作用[21]，NfD14a與王閔霞等[22]對水稻Dwarf 14（D14）的亞細胞定位預測結果一致，同樣是定位于葉綠體中，但是亞細胞定位結果顯示NfD14a和NfD14b均定位于煙草葉片原生質體的細胞核和細胞質，與水稻和擬南芥的D14基因的定位結果一致[13-14]，表明青天葵、水稻和擬南芥的D14基因細胞結構中的表達情況相似。2個NfD14基因在青天葵中的發育或應激反應中是否具有不同的作用有待進一步發現。本研究為進一步鑒定NfD14基因的功能提供依據，為青天葵中獨腳金內酯信號轉導途徑調控植物分枝生長發育機制的研究奠定了基礎。

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