不同地區橡膠樹紅根病菌的生物學特性及室內毒力測定

賀春萍 李銳 梁艷瓊 吳偉懷 黃興 習金根

摘? 要? 橡膠樹紅根病是我國分布最廣、危害最重的橡膠樹根部病害。為明確我國海南和云南地區橡膠紅根病菌的生物學特性及對殺菌劑的敏感性，采用十字交叉法研究了不同培養條件對病菌菌絲生長的影響，并測定了10種不同殺菌劑對病菌的抑制作用。結果表明，病原菌在玉米+橡膠根的培養基上生長最快，對溫度、pH等適應范圍廣，溫度在13～31 ℃，pH在3～10均能生長，最適生長溫度為28 ℃，多數菌株最佳pH為7～9，且能利用多種碳氮源;不同的碳源中，果糖、半乳糖、麥芽糖、葡萄糖和甘露糖較適合該菌的生長;在供試氮源中，菌絲在酪氨酸、牛肉浸膏的基礎培養基上生長最快，在色氨酸和尿素的基礎培養基上生長最慢;光照對病菌有抑制作用，黑暗有利于菌絲生長;菌絲的致死溫度為47 ℃，10 min。不同地區的病原菌株間藥劑敏感性存在一定差異，戊唑醇抑菌效果最好，其EC50為0.0312 μg/mL，其次為嘧菌酯、十三嗎啉、咪鮮胺和腈菌唑，EC50分別為0.5581、0.6759、1.3763和1.5603 μg/mL。

關鍵詞? 橡膠樹紅根病;橡膠靈芝菌;生物學特性;室內毒力

中圖分類號? S763.7? ? ? 文獻標識碼? A

橡膠樹紅根病是我國分布最廣、發病率最高、危害最為嚴重的橡膠樹根部病害，其病原菌具潛伏期長[1]、寄主范圍廣[2]、在土壤中蔓延迅速[3]和防治困難的特點，致使干膠產量損失嚴重和樹體死亡。據調查，橡膠樹紅根病發病率為10%～40%，若發病未及時處理，死亡率可達100%[4]。該病害是限制我國橡膠單產提高的重要生物因子，近年來危害有愈加嚴重的趨勢。1931年，Corner[5]將橡膠樹紅根病菌鑒定為橡膠樹靈芝 [Ganoderma pseudoferreum （Wakef） Over. et Stei n -

m];張運強等[6-7]、彭軍等[8]研究表明我國橡膠樹

紅根病菌有2個種群，分別為G. philippii（與G. pseudoferreum是同物異名）和G. gibbosum。當前防治橡膠樹紅根病主要采用十三嗎啉[9-11]灌根，該藥劑雖防效不錯，但價格昂貴，長期使用出現防效下降現象[11]。為尋找高效、低成本防治藥劑，李四有等[12]開展了8種殺菌劑對病原菌的毒力測定，藍志南等[13]采用百枯凈和蟲線清、何其光等[14]通過丙環唑與三唑酮混配藥劑進行橡膠樹紅根病的田間防治試驗，黃雅志等[15]、余卓桐等[16]等對該病害的防治措施亦開展了研究。由于橡膠樹紅根病菌存在不同的種和變種，明確不同地區病原菌的生物學特性及其對不同殺菌劑的敏感性，對生產上指導該病害的防控意義重大。2008年，張賀等[17]對橡膠樹紅根病菌生物學特性進行研究，但研究僅限于一株橡膠樹紅根病菌的生物學特性，而對其他省和地區的橡膠樹紅根病菌缺乏系統的生物學研究。除張賀的研究外亦未見其他關于該病病原菌生物學特性方面的研究報道。為此，本文對采自海南省和云南省不同地理環境的6株橡膠樹紅根病菌菌株進行生物學特性研究，分析比較不同來源的病原菌株間生物學特性的差異，同時測定10種殺菌劑對不同地區、不同種群的2株病原菌的抑菌能力，為有效防治該病害提供科學依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試病原菌：橡膠樹紅根病菌菌株Gp002、Gp010和Gp013分別采自云南省景洪市、河口縣螞蟥堡農場和紅河州，Gp038、Gp040和Gp044分別采自海南中坤農場、中國熱帶農業科學院試驗場和海南儋州蘭洋農場，由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所分離、鑒定與保存。其中菌株Gp010為G. gibbosum 種群，其余菌株為G. philippii種群。

培養基：橡膠根汁培養基、玉米粉培養基（CMA）、CMA+橡膠根汁培養基[18]、PSA培養基、PDA培養基、PDA+酵母培養基、PDA+酵母橡膠根汁培養基、面粉培養基（FA）、FA+橡膠根汁培養基、Czapek培養基、燕麥培養基（OA）、OA+橡膠樹根汁培養基，培養基配方參考賀春萍等[19]。

供試殺菌劑：在預試驗基礎上，確定各藥劑最低抑制質量的濃度，配制6個質量濃度梯度的含藥PDA培養基平板。殺菌劑種類、廠家及供試濃度見表1。

1.2? 方法

1.2.1? 培養基對病原菌菌絲生長的影響? 將純化的病原菌制成直徑為7 mm的菌餅，分別接種于1.1的供試培養基上，置于28 ℃恒溫培養箱中培養，觀察菌絲生長狀況。7 d后用十字交叉法測量菌落直徑，每處理重復4次。

1.2.2? 溫度對病原菌菌絲生長的影響? 將純化的病原菌制成直徑為7 mm的菌餅，接種于PDA培養基上，分別置于5、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37和40 ℃恒溫培養箱中培養，觀察菌絲生長情況。7 d后用十字交叉法測量菌落直徑，每處理重復4次。

1.2.3? pH對病原菌菌絲生長的影響? 用滅菌NaOH（1 mol/L）和HCl（1 mol/L）將PDA培養基的pH分別調至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。然后采用1.2.2節中的方法接種和測量菌落直徑。每處理重復5次，連續測量7 d。計算其菌落平均生長直徑。

1.2.4? 光照對病原菌菌絲生長的影響? 從菌落邊緣取直徑為7 mm菌餅接種于PDA培養基上，分別置于24 h光照（日光燈，18 W）、光暗交替

1.2.5? 碳源、氮源對病原菌菌絲生長的影響? 參照賀春萍等[19]的方法，測定12種碳源和13種氮源對不同地區橡膠樹紅根病菌菌株生長的影響。每處理重復4次。28 ℃培養，培養至7 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.6? 致死溫度測定? 取滅菌具塞玻璃試管，分別置于40、45、47、49、51、53、55 ℃恒溫水浴鍋中，當試管內溫度達到設定溫度值時，加入2 mL菌絲懸浮液水浴10 min，室溫中放置未水浴的試管作對照，每處理重復4次。后取經過處理的菌絲懸浮液0.2 mL在PDA培養基上涂勻，28 ℃培養。168 h后觀察有無菌落生長。詳情參考賀春萍等[19]方法。

1.2.7? 殺菌劑對病原菌菌絲生長的影響? 參照賀春萍等[20]的方法，配置6個不同濃度梯度的供試藥液，制作系列濃度的含藥平板。選取在PDA平板上培養7～14 d的代表性菌株Gp010（云南）和Gp038（海南），從菌落邊緣取直徑7 mm的菌餅接種于含藥PDA培養基上，28 ℃培養7～14 d，測量菌落直徑，并計算抑制率。每處理重復5次。

1.3? 數據統計

采用SAS 8.02軟件進行數據分析，差異顯著性采用Duncan氏新復極差法檢驗。

2? 結果與分析

2.1? 培養基對菌絲生長的影響

培養基對不同菌株生長有顯著影響（表2）。供試的2株病菌在12種不同培養基上均能生長，不同菌株在不同培養基上的生長速率有所差異。菌株Gp010最適培養基為OA+橡膠樹根汁和CMA+橡膠樹根汁，培養7 d菌落直徑分別為5.25 cm和5.15 cm;菌株Gp038最適培養基為CMA和CMA+橡膠樹根汁，培養7 d菌落直徑分別為4.31 cm和4.28 cm。

2.2? 溫度對菌絲生長的影響

在PDA平板上，供試的6株菌株在10 ℃以下和37 ℃以上條件下都停止生長，13～31 ℃溫度下均能生長;除Gp010最適生長溫度為31 ℃外，其余5株病原菌的最適生長溫度均為28 ℃（表3）。除Gp010在34 ℃條件下還能少許生長外，其余5株供試病原菌在34 ℃時菌絲都不能生長。另外，在不同溫度下各菌株生長情況略有差異，以菌株Gp010的菌落生長最快。

2.3? pH對菌絲生長的影響

不同pH條件下病菌菌絲生長速率測定結果表明，各菌株在pH 3～10的范圍內均能生長;在不同pH條件下，菌株生長速率存在一定差異（表4）。菌株Gp038和Gp044的最適生長pH為9，菌株Gp013的最適生長pH為8，菌株Gp040的最適生長pH為4，菌株Gp010的最適生長pH范圍最寬為7～10，菌株Gp002的最適生長pH為6～7。

2.4? 光照對菌絲生長的影響

在持續光照、光暗交替和完全黑暗3種條件下病菌均能生長，且供試菌株的菌絲生長速率各不相同（表5）。所有參試的病菌菌絲在無光條件下生長速率明顯比有光條件下快，完全黑暗條件最適合紅根病菌菌絲的生長。

2.5? 碳、氮源對菌絲生長的影響

碳源對不同菌株生長有顯著影響，菌株間對不同碳源的利用差異較大（表6）。在供試的12種碳源中，菌株Gp002以半乳糖、麥芽糖、山梨糖、蔗糖、可溶性淀粉和葡萄糖為最佳碳源，菌株Gp013以半乳糖和麥芽糖為最佳碳源，菌株Gp010和Gp040以果糖為最佳碳源，菌株Gp044以甘露糖為最佳碳源，而菌株Gp038以葡萄糖、乳糖、麥芽糖、半乳糖、鼠李糖、蔗糖、木糖、甘油為最佳碳源。

氮源對不同菌株生長的影響顯著（表7）。菌株Gp002和Gp038以酪氨酸為最佳氮源，菌株Gp013和Gp040以牛肉浸膏為最佳氮源，菌株Gp010以蛋白胨、牛肉浸膏、酪氨酸、丙氨酸、酵母浸膏、甘氨酸和胱氨酸為最佳氮源，而菌株Gp044則以牛肉浸膏、蛋白胨和酵母浸膏為最佳氨源。各供試菌株在其余幾種氮源間菌絲生長存在較大差異，其中硝酸鈉、氯化銨、色氨酸和尿氨酸的利用率最差。

2.6? 致死溫度測定

參試病菌菌絲在40 ℃、45 ℃恒溫水浴10 min，菌絲仍能生長，但在≥47 ℃恒溫水浴10 min后菌絲不能生長。說明參試的6株橡膠樹紅根病菌菌絲的致死溫度為47 ℃（10 min）。

2.7? 殺菌劑對菌絲生長的影響

2.7.1? 殺菌劑對橡膠樹紅根病菌EC50值的比較分析? 供試殺菌劑對來自海南和云南地區不同種群的2株橡膠樹紅根病菌的菌絲生長抑制作用差異較大（表8）。各藥劑對病菌的毒力測定結果表明，戊唑醇、嘧菌酯、十三嗎啉、咪鮮胺和腈菌唑5種藥劑對病菌具有顯著抑制作用，其平均EC50值均小于2 μg/mL，分別為0.0312 μg/mL、0.5581 μg/mL、0.6759 μg/mL、1.3763 μg/mL和1.5603 μg/mL;三唑酮、百菌清和異菌脲對紅根病菌也有較強的抑制作用，平均EC50值分別為4.1727 μg/mL、4.2787 μg/mL和4.8868 μg/mL。抑霉唑和甲基托布津的抑制作用相對較弱，其平均EC50值分別為14.1650 μg/mL和18.9393 μg/mL。2.7.2? 橡膠樹紅根病菌對殺菌劑的敏感性分析? ?由表8可知，10種藥劑對2株橡膠樹紅根病菌的斜率值均不相同，2株紅根病菌菌株的斜率范圍在0.5362～8.4468，其中十三嗎啉、咪鮮胺、抑霉唑和嘧菌酯的平均斜率值分別為0.7832、0.9241、0.8442和0.9578，而其余6種藥劑的平均斜率值均大于1。10種供試藥劑斜率值最大差異范圍為1.2234～4.1016倍，表明來源不同的菌株對相同藥劑的敏感性亦存在較大差異。

3? 討論

紅根病是橡膠樹最重要的根部病害，目前已成為阻礙橡膠產業持續發展的重要生物限制因素。研究發現我國橡膠樹紅根病菌有2個種群（G. philippii和G. gibbosum）[6-8]，明確橡膠樹紅根病菌的生物學特性以及測定不同殺菌劑對病菌的室內毒力，對生產上指導該病害的防控意義重大。

本文通過對云南、海南兩省的橡膠樹紅根病菌生物學特性研究表明，紅根病菌對pH適應范圍廣，pH 3～10范圍內均能生長，云南地區橡膠紅根病菌在pH為6～9時，菌絲生長較好，說明云南菌株對堿性環境的適應性較好;海南地區橡膠紅根病菌菌株Gp038和Gp044在pH為7～9，而菌株Gp040 pH為3～5時，菌絲生長較好，海南菌株多數對堿性環境適應性較好。以上研究結果與張賀等[17]報道的病菌菌絲在pH為4～8范圍內均能生長、最適生長pH為6～7有些差異，這可能與不同地區的酸堿土質有較大關系，是造成兩省菌株差異的主要原因。張賀等[17]研究表明，紅根病病菌菌絲的致死溫度為62 ℃（10 min），而本研究表明海南、云南地區病原菌的致死溫度為47 ℃（10 min），這可能與不同地區的病原菌對熱的忍耐程度不同有關系。

通過溫度試驗發現，橡膠樹紅根病菌對溫度的適應范圍廣，溫度在13～31 ℃均能生長，除云南地區紅根病菌菌株Gp010最適生長溫度為31 ℃外，其余5個菌株最適生長溫度均為28 ℃;在不同溫度下各地區菌株菌落直徑差異較大，其中菌株Gp010菌落生長最快，菌絲生長較均一，且菌落較圓。以上研究與張賀等[17]的報道基本一致，張賀等對橡膠樹紅根病菌生物學特性的研究表明，該病病原菌的最適生長溫度為28 ℃，而本研究表明不同種群的紅根病菌最適生長溫度有差異，G. gibbosum種群菌株Gp010最適溫度為31 ℃，而G. philippii種群的其余5株供試菌的最適溫度為28 ℃。菌株對不同碳源的利用程度各異，果糖、半乳糖、麥芽糖、葡萄糖和甘露糖適合該菌的生長。不同氮源對菌株生長有顯著影響，以牛肉浸膏、酪氨酸對菌株生長促進作用最大，而在色氨酸和尿氨酸的基礎培養基上生長最慢。

目前，化學防治仍然是橡膠樹根病綜合防治的重要措施。殺菌劑室內毒力測定中EC50值越小、斜率越大，表明病菌對藥劑的敏感性越大。本研究以10種供試藥劑對不同地區和種群的2株橡膠樹紅根病菌菌絲體生長的EC50值和毒力回歸方程斜率的分析發現，戊唑醇、嘧菌酯、十三嗎啉、咪鮮胺和腈菌唑5種藥劑對橡膠樹紅根病菌的平均EC50值在0.0312～1.5603 μg/mL之間，表明這5種藥劑對橡膠樹紅根病菌的抑菌效果較好。其中十三嗎啉和咪鮮胺的斜率值稍小，這可能與它們長期用于防治橡膠根病、白粉病和炭疽病有關。在參試的10種藥劑中甲基托布津斜率最大，但其EC50值也最大，抑菌活性較小;抑霉唑和甲基托布津這兩種藥劑的抑菌效果相對較差。本文采用農藥原藥進行室內毒力測定，研究結果較客觀、準確，研究結果與李四有等[12]研究結果相似，其中三唑類殺菌劑、十三嗎啉、咪鮮胺等藥劑對橡膠樹紅根病菌具較強的抑制作用。本研究篩選出的戊唑醇、嘧菌酯、咪鮮胺、腈菌唑等殺菌劑有望作為十三嗎啉的替代藥劑應用于橡膠樹紅根病的防治。

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