建蘭花葉病毒RT-LAMP檢測方法的建立

樊榮輝 黃敏玲 鐘淮欽 羅遠華

摘? 要? 建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CyMV）是侵染蘭花的主要病毒，嚴重影響其觀賞價值，建立快速、靈敏的檢測方法顯得尤為重要。根據CyMV的外殼蛋白基因序列設計4對特異性引物，經過優化反應條件，建立該病毒的RT-LAMP 檢測方法，并進行LAMP檢測的特異性、敏感性檢測。該方法能特異擴增CyMV，與其他4種病毒（齒蘭環斑病毒、菜豆黃花葉病毒、黃瓜花葉病毒和小蒼蘭花葉病毒）不發生反應;靈敏度為RT-PCR的10倍。田間檢測20份樣品中，RT-LAMP和RT-PCR檢測結果一致，檢出率為60%。在產物中加入熒光染料SYBR GreenⅠ，直接用肉眼觀察就可判斷樣品是否感染CyMV，可省去電泳分析的時間。針對CyMV建立的RT-LAMP方法具有特異性強、靈敏度高、操作簡單、快速等特點，適用于在進境檢疫及種苗繁育過程中的檢測鑒定。

關鍵詞? 建蘭花葉病毒;RT-LAMP;檢測

中圖分類號? S436.8? ? ? 文獻標識碼? A

建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CyMV）是蘭花中最嚴重的病毒之一，洋蘭（蝴蝶蘭、石斛蘭、文心蘭等）主要由CyMV病毒單獨侵染為主[1]。蘭花受CyMV侵染后出現花葉、畸形、壞死及花瓣變色等癥狀，導致品質下降，影響觀賞價值，制約蘭花產業發展[2-3]。目前尚缺乏有效防治建蘭花葉病毒的藥劑，最有效方法是培育無毒種苗，而這就需要對種苗進行病毒檢測及鑒定。因此，建立快速、靈敏的檢測技術尤為重要。目前，對CyMV的檢測主要集中在酶聯免疫法（ELISA）和RT-PCR技術。2006年，Lee等[4]建立了CyMV與其他病毒的多重RT-PCR檢測技術，2008年，Lee等[5]建立了CyMV的抗血清技術。這些技術能有效檢測CyMV，并對后續新技術出現提供借鑒。酶聯免疫法是目前較常用的一種方法[6]，但也存在靈敏度不高、易出現假陽性等缺點。PCR技術已成為常規檢測手段[7]，但由于實驗設備要求比較高，不利于向基層檢驗部門推廣。環介導等溫核酸擴增技術（Loop-me diated isothermal amplification，LAMP）應用4條特異性引物，通過Bst DNA聚合酶，在水浴鍋中對靶基因進行的一種恒溫擴增技術[8]，該技術具有擴增特異性強、靈敏度高、操作快速簡便、檢測簡單等特點，擺脫了對PCR儀等昂貴儀器的依賴[9-11]，在基層的檢測更加方便。本研究對CyMV的保守外殼蛋白（CP）基因設計4條特異性引物，并對其靈敏性和特異性進行驗證，建立了可特異檢測該病毒的RT-LAMP檢測方法，以期為蘭花種苗篩選提供可靠簡便的檢測方法，也利于基層檢疫部門進行進出口檢測。

1? 材料與方法

1.1? 材料

感染了建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus， CyMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、小蒼蘭花葉病毒（Freesia mosaic virus，FreMV）、齒蘭環斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV）、菜豆黃花葉病毒（Bean yellow mosaic virus，BYMV）的陽性樣品及健康對照樣品的葉片均由本實驗室保存。

熒光染料SYBR GreenⅠ購自北京鼎國公司;Bst聚合酶、MgSO4購自New England Biolabs（美國）;EcoR I、PMD18-T載體、JOM109 感受態細胞均購自TaKaRa;甜菜堿購自Sigma（美國）。

1.2? 方法

1.2.1? RT-LAMP 體系的建立? 取感染病毒的葉片，按照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）方法提取樣品的總RNA。

根據GenBank公布的CyMV較保守的CP基因序列為靶標基因（AY429021、HQ644132、GU295168、AF016914、EU672821和GQ507023），設計得到6區域的4條特異性引物，其中F3和B3為外引物，FIP和BIP為內引物（表1）。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

反應體系（25 μL）：10×Bst buffer 2.5 μL、 25 mmol/L MgSO4 4 μL、5 mmol/L Betaine 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL 、8 U/μL Bst聚合酶1 μL、20 μmol/L FIP 2 μL、20 μmol/L BIP 2 μL、10 μmol/L F3 0.5 μL、10 μmol/L B3 0.5 μL、 ddH2O 2 μL、cDNA 2.5 μL。反應條件為：65 ℃、60 min，80 ℃、5 min。進行瓊脂糖凝膠電泳分析;同時產物中加入SYBR GreenⅠ，目視觀察結果。

1.2.2? RT-LAMP 產物酶切鑒定? 為了進一步驗證LAMP擴增的正確性，在設計LAMP引物時加入了EcoRⅠ酶切位點（gaattc）。將LAMP反應產物電泳后，梯形條帶進行膠回收，再用EcoR Ⅰ37 ℃酶切過夜，連接于PMD18-T載體上，用JOM109感受態細胞轉化，測序。

1.2.3? 特異性和靈敏度驗證? 對感染ORSV、FreMV、CMV、BYMV、CyMV的陽性樣品，分別提取總RNA，應用RT-LAMP檢測，瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

對感染CyMV陽性樣品的總RNA，進行10、102、103、104、105倍梯度稀釋，分別進行RT-LAMP 和 RT-PCR靈敏度檢測。

運用RT-LAMP和RT-PCR技術，對田間隨機采集的10份建蘭和10份文心蘭樣品進行特異性檢測和驗證。

2? 結果與分析

2.1? RT-LAMP

通過反應體系的優化，建立了能擴增CyMV的RT-LAMP 反應體系（圖1），RT-LAMP反應產物有階梯狀的條帶，陰性對照未發現條帶;加入 SYBR GreenⅠ，混勻，RT-LAMP反應產物為黃綠色，陰性對照為橙色。

2.2? RT-LAMP反應產物的酶切驗證

將LAMP產物膠回收后，用EcoRⅠ酶切如圖2，并進行轉化測序，最終得出，酶切出的片段為目標基因的F2-B2的序列，包括酶切堿基在內大小為165 bp。證明該體系擴增產物為靶基因。

2.3? 特異性驗證

以分別感染ORSV、BYMV、FreMV、CMV和CyMV的樣品總RNA為模板，進行RT-LAMP 擴增。如圖3所示，只有CyMV有梯狀條帶，檢測結果為陽性，其他不產生條帶，說明建立的檢測體系對CyMV檢測有較好特異性。

2.4? 靈敏度檢測

對不同濃度稀釋后的RNA，分別進行 RT-LAMP和RT-PCR反應。結果顯示，RT-LAMP在稀釋1000倍時，仍能檢測出CyMV，而RT-PCR在稀釋100倍還能檢測出CyMV，稀釋1000倍時，未檢出（圖4），表明RT-LAMP檢測CyMV的靈敏度是RT-PCR的10倍。

2.5? 田間樣品測定

隨機采取建蘭和文心蘭樣品各10份，分別進行RT-LAMP和RT-PCR檢測，結果顯示，兩者檢測結果一致，建蘭有4份樣品呈陽性，文心蘭有8份樣品呈陽性（表2），表明RT-LAMP檢測技術能應用于田間樣品。

3? 討論

蘭花是中國四大名花之一，代表高貴、典雅，具有極高的觀賞和收藏價值。但當病毒病侵染時，植株會出現畸形、壞死，從而造成品質下降，這是制約蘭花大規模生產的重要因子。為滿足消費需求，培育無病毒苗是防止病毒病的重要措施，因此，建立快速、準確、高效的檢測方法，對阻止病毒病的傳播有良好作用;或對脫毒苗進行檢測，從根源上預防病毒病也具有重要意義。本試驗針對建蘭花葉病毒建立的環介導等溫擴增技術具有擴增快速高效、特異性好、操作簡便、不需要特殊儀器等優點，可以針對性地對蘭花脫毒種苗進行檢測，從種源遏制病毒病的發生。本研究技術具有較高的應用價值，在基層和現場檢測中有很好的應用前景。

目前，病毒檢測的常用方法是PCR和ELISA技術，均且具有較好的檢測效果，但也存在耗時長，成本高的特點，不太適用于基層檢測。與常規PCR方法相比，本研究所建立的LAMP技術，在保持PCR技術優點的基礎上，不需特殊儀器，成本低，且由于不需要熱循環，整個過程可以在60 min內完成，更加省時，檢測結果若采用加入SYBR GreenⅠ目測的方式，檢測更快捷方便。因此該方法特別適合在基層中應用。

LAMP 技術使用4～6條引物，會進一步增強反應的特異性[12-13]。引物設計至關重要，也較復雜和困難，除要遵循一般引物設計原則外，還有LAMP 引物設計自身要注意的事項[14]，特別是對于病毒多個生理小種間保守的CP基因差異明顯或GC含量較高序列設計更加困難[15]。本研究針對建蘭花葉病毒CP基因設計引物，經驗證該引物的特異性良好。同時，本研究建立的檢測CyMV的RT-LAMP方法靈敏度較高，比常規PCR靈敏度高10倍，對于病毒含量很少的脫毒苗的快速檢測方面有一定的優勢。LAMP方法靈敏度高，容易出現假陽性，因此本研究采用在RT-LAMP 反應管蓋上滴加SYBR green I染色劑，待反應結束后在不開蓋的情況下直接使染色劑與擴增產物混合，以此減少反復開蓋而造成的污染問題。

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