廣東花生黑腐病病原菌鑒定及防治藥劑的室內毒力測定

李娜 王澤鈿 何桂碧 向梅梅 張云霞

摘? 要? 花生黑腐病是花生的重要病害，對生產造成嚴重影響，被列為我國進境植物檢疫性病害。為明確花生黑腐病的病原菌種類和篩選有效防治藥劑，采用形態學特征與分子生物學技術相結合的方法，對花生黑腐病害進行了病原菌鑒定，同時采用菌絲生長速率法測定了8種殺菌劑對花生黑腐病菌的抑制作用。結果表明：花生黑腐病害的病原菌為冬青麗赤殼Calonectria iliciola。8種殺菌劑室內毒力測定結果顯示，10%戊唑醇EC對花生黑腐病菌的毒力最強，EC50值為1.12 μg/mL;300 g/L苯甲·丙環唑EC、29%吡萘嘧菌酯SC、25%咯菌腈SC、15%吡唑嘧菌酯SC和22.5%啶氧菌酯SC對花生黑腐病菌也有較好的抑制作用，EC50均低于10 μg/mL;30%精甲惡霉靈的抑制作用最差，EC50值為76.71 μg/mL。以上研究結果可為花生黑腐病的防治提供理論依據。

關鍵詞? 花生;黑腐病;殺菌劑;毒力測定

中圖分類號? Q93? ? ?文獻標識碼? A

花生（Arachis hypogaea）是我國重要的油料作物，黑腐病是影響花生生產的重要病害之一。1965年，美國喬治亞州首次發現該病害，隨后，迅速擴散至美國東南部的花生種植區，受害嚴重時損失率高達50%[1-2]。目前該病害分布于美國、日本、韓國、澳大利亞等10多個國家[3]。2009年，我國廣東省首次發現花生黑腐病，隨后，在福建、江西和云南等省先后發現該病害[4-7]。2010年，廣東省農業廳將該病原菌增列入《廣東省農業植物檢疫性有害生物補充名單》。

花生黑腐病主要通過土壤和種子帶菌傳播，病害一旦發生，防控極為困難。目前花生黑腐病沒有高抗的品種，農業防治極其困難，土壤熏蒸具有一定的效果，但費用高且易造成環境污染[8]，迄今沒有有效的防治措施。本文擬在病原菌鑒定的基礎上，對病原菌進行殺菌劑的室內毒力測定和有效藥劑的篩選，為生產上病害的防治提供科學依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試菌株? 供試菌株于2017年5月采自廣東省翁源縣三華鎮，從發病組織的根莖部分離獲得病原菌。

1.1.2? 供試培養基? 病原菌分離用培養基為馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）、菌落形態鑒定培養基為麥芽汁培養基（MEA），顯微形態觀察培養基為康乃馨葉片培養基（CLA）。單菌絲分離培養基為水瓊脂培養基（WA）。

1.1.3? 供試藥劑? 供試殺菌劑共8種：30%精甲噁霉靈水劑、10%戊唑醇乳油，浙江禾本科技有限公司;22.5%啶氧菌脂酯懸浮劑，上海農化生化有限公司;20%噻夫吡唑醚懸浮劑、15%吡唑醚菌酯懸浮劑，北京燕化永樂生物科技有限公司;29%吡萘嘧菌脂懸浮劑、300 g/L苯甲·丙環唑乳油、25%咯菌腈懸浮劑，瑞士先正達作物保護有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 病原真菌的分離和純化? 參照方中達[9]的組織分離法：新鮮病株的莖基部病組織切成3 mm×3 mm小塊，依次用75%酒精消毒10～15 s、2.5%次氯酸鈉消毒25～35 s，無菌水洗滌3次，再用無菌濾紙吸干水分，移至PDA平板、25 ℃培養。待菌落長出后，純化并保存菌種。

單菌絲分離：挑取菌落邊緣少量菌絲，放入WA培養基上，25 ℃培養24 h，于顯微鏡下切取單根菌絲，放入MEA培養基上，25 ℃恒溫黑暗培養。

1.2.2? 病原菌的致病性測定? 參照袁匯濤[10]的方法：花生種子水培發芽后，選取長勢好的幼芽，于菌絲懸浮液中浸泡10 min，以無菌水處理為對照，每個處理接種5株。將接種處理后的幼芽插入水培棉中，移入裝有水的托盤中，25 ℃光照培養，觀察發病情況。

1.2.3? 病原真菌的形態學鑒定? 參照Lombard等[11]的方法。在培養5 d后獲得單菌絲菌落的邊緣打孔，取菌餅置于新的MEA培養基上，于25 ℃條件下培養，觀察菌落特征。取菌餅置于CLA培養基上，于25 ℃條件下培養，待產孢后于光學顯微鏡下觀察其顯微形態結構，拍照并測量分生孢子、產孢細胞和泡囊大小。

1.2.4? 病原真菌的分子鑒定? 采用CTAB法提取待鑒定菌株的DNA。參照Carbone等[12]的方法，選取組蛋白H3（histone H3，HIS3）、翻譯延伸因子-1α（translation elongation factor 1-alpha，TEF- 1α）和β-微管蛋白（β-tubulin，TUB2）共3個基因序列進行PCR擴增。

特異性引物：HIS3選用引物CYLH3F和CYLH3R[13]。TEF-1α選用引物EF1-728F[12]和引物EF2[14]。TUB2選用引物CYLTUB1R[13]和T1[15]。

PCR反應體系（總體積25 μL）：2×Taq PCR Green Mix 12.5 μL，DNA模板2 μL，10 μmol/L上游引物和下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL。

His3 和TEF-1α的PCR擴增程序：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環;72 ℃終延伸10 min。TUB2的退火溫度為50 ℃。

將得到的PCR擴增產物送至上海英濰捷基貿易有限公司測序，最后將獲得的序列在NCBI網站上進行BLAST同源性比對分析。

1.2.5? 室內毒力測定試驗? 含毒培養基的配制：每種供試藥劑按有效成分含量分別用無菌水稀釋成一定濃度梯度的母液，向PDA培養基中加入已配制好的殺菌劑母液，制成不同濃度梯度的含藥平板。根據預試驗結果每種藥劑設置5個處理濃度（100、10、1、0.1、0.01 μg/mL）。CK加入等量的無菌水于PDA培養基作空白對照。

菌落測定方法：供試菌株培養5 d后，用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打孔，取菌餅接種于含毒培養基中央，每個處理5個重復。接種后的平板置于25 ℃培養箱中培養。待對照菌落長滿培養皿時，采用“十”字交叉法測量各處理的菌落直徑，計算平均值，得出抑菌率。抑菌率=（對照組菌落直徑藥劑處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑菌餅直徑）100%。

以藥劑濃度對數值為橫坐標（x），以校正抑菌率幾率值為縱坐標（y），得到線性回歸方程y=a+bx和相關系數r值。計算供試藥劑對花生黑腐病菌的抑菌中濃度EC50及EC95值，比較各供試藥劑的抑制效果及花生黑腐病菌對各供試藥劑的敏感性。

2? 結果與分析

2.1? 花生黑腐病菌的病原菌鑒定

2.1.1? 花生黑腐病的癥狀及致病性測定? 花生幼苗期和成株均可受害，受害莖基部和果針上出現黑色的凹陷病斑，莢果和根受害后期會變黑腐爛，植株葉片變黃、萎蔫，嚴重時枯死。在潮濕狀況下，發病部位產生紅色的子囊殼（圖1）。

健康的花生幼苗在接種5 d后接種部位開始出現褐色小病斑，病斑逐漸擴大蔓延至整條根變褐色，后期植株萎蔫。接種發病癥狀與田間病狀一致。對照組未發病。

從接種發病的植株進行再分離，得到的菌落形態和顯微形態與接種菌株一致，說明分離菌株為花生黑腐病的病原菌。

2.1.2? 花生黑腐病病原菌的形態學鑒定? MEA培養基上菌落初期為白色，逐漸變為灰白色至淺褐色，菌落背面中央紅褐色，邊緣白色。氣生菌絲絨毛狀，茂盛，菌落邊緣較整齊（圖2A，圖2B）。

在CLA培養基上培養，分生孢子梗多級帚狀分枝，分枝末端產生2～4個瓶梗，大小為（10～25）μm（3～6.5）μm;末端泡囊球形或近球形，大小為（15～28）μm（5.5～15）μm，延伸梗具隔膜，大小為（200～280）μm（3.5～6.5）μm;大型分生孢子直，圓柱形，無色透明，一端稍窄，大小為（60～75）μm（7.5～8.0）μm，1～3個隔膜，隔膜處縊縮不明顯。子囊殼卵球形或近球形，紅褐色，單生或聚生，大小為（300～600）μm（300～500）μm;子囊棍棒狀，每個子囊含8個子囊孢子;子囊孢子紡錘形，直或稍彎，無色透明，兩端鈍圓，1～3個隔膜，隔膜處稍有縊縮，大小為（30～85）μm （5～9.5）μm（圖2C～圖2J）。其顯微形態結構與Pan等[4]報道的冬青麗赤殼Calon ectria ilicicola基本一致。

2.1.3? 花生黑腐病病原菌的分子鑒定? 利用翻譯延伸因子-1α（TEF-1α）蛋白H3（HIS3）和β-的DNA序列在NCBI網站上進行BLAST比對，實驗菌株ws（NCBI登錄號為MK120359、MK120360、MK120361）與Calonectria ilicicola（NCBI登錄號為AY725728.1、GQ267256.1、EF159730.1）的相似度最高，都為99%。因此，根據形態學特征和DNA序列分析，將分離的花生黑腐病的病原菌鑒定為C. ilicicola。

2.2? 花生黑腐病菌毒力測定

2.2.1? 供試藥劑對花生黑腐病菌的毒力活性? EC50值的大小是衡量殺菌劑對病原菌毒力作用的重要指標。8種供試藥劑對花生黑腐病菌表現出不同的毒力作用，抑菌效果存在明顯的差異（表1）。其中，戊唑醇對花生黑腐病菌毒力最高，EC50為1.12 μg/mL，其次為苯甲·丙環唑、吡萘嘧菌酯、咯菌腈、吡唑嘧菌酯、啶氧菌酯，EC50均低于10 μg/mL，精甲噁霉靈對花生黑腐病菌毒力最低，EC50為76.71 μg/mL。

2.2.2? 花生黑腐病菌對殺菌劑敏感性比較? 毒力測定試驗中，回歸方程的斜率越大說明病原菌對藥劑的反應敏感性越強。由表1可知，花生黑腐病菌對吡萘嘧菌酯最敏感，其次為戊唑醇、精甲噁霉靈、苯甲·丙環唑、噻夫吡唑醚，花生黑腐病菌對吡唑嘧菌酯和啶氧菌酯敏感性較低。

3? 討論

本研究通過對標準條件下菌落特征、形態學特征及3個基因的DNA序列分析，明確了采自廣東省翁源縣的花生黑腐病菌為冬青麗赤殼（Calonectria iliciola）。該結果和Pan等[4]的研究一致。前人研究中，花生黑腐病菌多以其無性態命名，為寄生帚梗柱孢菌（Cylindrocladium parasiticum），按照真菌分類命名的最新法則[16]，該屬真菌應以有性態命名，所以花生黑腐病菌應訂正為冬青麗赤殼（Calonectria iliciola）。

已有研究表明，三唑類的殺菌劑對Calonectria引起的植物病害具有較好的效果。馬海賓等[17]在研究殺菌劑對桉樹焦枯病菌（Cy. quinqueweptatum）毒力作用時發現，供試的6種殺菌劑中戊唑醇對桉樹焦枯病菌的毒力最高，EC50為4.1237 mg/L。在林地防效中，丙環唑使桉樹林地的病情指數下降33%。本研究中，戊唑醇對花生黑腐病菌毒力最高，其次為苯甲·丙環唑，研究結果與其一致。由于殺菌劑的室內毒力測定結果不能完全反映其大田的防效，因此戊唑醇對花生黑腐病菌的田間防效還需要進一步大田驗證。

花生黑腐病菌在我國南方地區發生普遍，生產中應引起重視。我國從2009年在廣東首次發現該病害后，相繼在福建、江西和云南等地發現有該病害危害[4-7]。本文作者前期調查發現，該病害在廣東省的大部分花生產區均有發生。目前對花生黑腐病的研究主要局限于病原菌上，而對該病的防治技術研究較少，僅袁匯濤[10]和藍國兵等[18]通過人工接種方法對花生黑腐病的抗病品種進行了篩選，對花生黑腐病藥劑方面的防治還未見報道。本研究結果可為花生黑腐病的藥劑防控提供一定的參考。

參考文獻

Bell D K， Sobers E K. A peg， pod and root necrosis of peanuts caused by a species of Calonectria[J]. Phytopathology， 1966， 56（12）： 1361-1364.

Wright L P， Andrew J D， Wingfield B D， et al. Population structure of Cylindrocladium parasiticum infecting peanuts in Georgia， USA[J]. European Journal of Plant Pathology， 2010， 127（2）： 199-206.

潘汝謙， 徐大高， 鄧銘光， 等. 外來入侵花生黑腐病菌在中國的風險性評估[J].中國農業科學， 2012， 45（15）： 3068-3074.

Pan R， Guan M， Xu D， et al. Cylindrocladium black rot caused by Cylindrocladium parasiticum newly reported on peanut in China[J]. Plant Pathology， 2009， 58（6）： 1176.

Pan R， Deng Q， Xu D， et al. First report of Cylindrocladium black rot of peanut caused by Cylindrocladium parasiticum in Fujian province， Eastern China[J]. Plant disease， 2012， 96（4）： 583.

Gai Y， Deng Q， Pan R， et al. First report of Cylindrocladium black rot of peanut caused by Cylindrocladium parasiticum （teleomorph Calonectria ilicicola） in Jiangxi province， China[J]. Plant disease， 2012， 96（4）： 586.

Pei W H， Cao J F， Yang M Y， et al. First report of black rot of Medicago sativa Caused by Cylindrocladium parasiticum （teleomorph Calonectria ilicicola） in Yunnan Province， China[J]. Plant Disease， 2015， 99.

Phipps P M. Control of Cylindrocladium black rot of peanut with soil fumigants having methyl isothiocyanate as the active ingredient[J]. Plant Disease， 1990， 74： 438-441.

方中達. 植病研究方法[M]. 北京： 中國農業出版社， 1998.

袁匯濤. 花生黑腐病抗病品種篩選及抗病機制初步研究[D]. 廣州： 仲愷農業工程學院， 2016.

Lombard L， Crous P W， Wingfeld B D， et al. Phylogeny and systematics of the genus Calonectria[J]. Studies in Mycol ogy， 2010， 66（3）： 31-69.

Carbone I， Kohn L M. Method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes[J]. Mycologia， 1999， 91（3）： 553-556.

Crous P W， Groenewald J Z， Risede J M， et al. Calonectria species and their Cylindrocladium anamorphs： species with sphaeropedunculate vesicles[J]. Studies in Mycology， 2004， 50： 415-430.

Donnell K O， Kistler H C， Cigelnik E， et al. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana： Concordant evidence from nuclear and mitocho ndrial gene genealogies[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1998， 95（5）： 2044-2049.

Donnell K O， Cigelnik E. Two divergent intragenomic rDNA ITS2 types within a monophyletic lineage of the fungus Fusarium are nonorthologous[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution， 1997， 7（1）： 103-116.

Wingfield M J， De Beer Z W， Slippers B， et al. One fungus， one name promotes progressive plant pathology[J]. Molecular Plant Pathology， 2012， 13 （6）： 604-613.

馬海賓， 康麗華， 崔寧寧， 等. 殺菌劑對桉樹焦枯病菌的毒力測定及林地防病效果[J]. 熱帶作物學報， 2010， 31（11）： 2006-2009.

藍國兵， 何自福， 佘小漫， 等. 廣東花生主要品種對黑腐病菌的抗性水平鑒定[J]. 生物安全學報， 2016， 25（3）： 214-217.