橡膠樹COP9家族基因的克隆及表達分析

吳紹華 張世鑫 鄧小敏 陳月異 田維敏

摘? 要? COP9信號小體（CSN）是進化上保守的蛋白復合體，在茉莉酸信號途徑中起著重要的作用。橡膠樹的乳管是一種特化的細胞器，是天然橡膠合成和儲存的場所。現有的證據表明橡膠的生物合成可能受到茉莉酸信號途徑的調控，但是對于茉莉酸信號途徑調控天然橡膠的生物合成還了解的不夠。本研究采用RACE技術結合RT-PCR從膠乳中克隆了8個CSN基因的全長cDNA序列，根據與擬南芥的相似性，分別命名為HbCSN1～HbCSN8。熒光定量PCR結果顯示，8個CSN基因均能在樹皮、不同發育時期的葉片、膠乳、雄花和雌花中表達，其中HbCSN5在膠乳中的表達量最高，其他成員在葉片中的表達量最高。而且，部分HbCSNs基因在膠乳中的表達受到割膠和茉莉酸甲酯處理的上調表達。因此，推測這些上調表達的成員可能參與膠乳的茉莉酸信號途徑。

關鍵詞? 巴西橡膠樹;COP9信號復合體;基因克隆和表達分析;進化樹分析

中圖分類號? S794.1? ? ? 文獻標識碼? A

COP9信號小體（COP9 signalosome）又稱CSN復合體，是一種進化上高度保守的多亞基蛋白復合體[1-2]。最初是鄧興旺等生物學家于1992年在擬南芥光形態建成的研究的過程中，采用T-DNA標簽技術，分離篩選到一系列突變體，這些突變株由于相應基因的缺失導致暗中的生長植物呈現出一種類似于光下生長的狀態，并克隆了COP1基因。隨后，他們又克隆了其他COP成員[3-6]。CSN也在多種有機體中相繼被發現，并且證實CSN復合體參與調控多個重要的生物過程。在高等真核生物，COP9信號小體由8個CSN成員組成，分別命名為CSN1～CSN8，其中6個亞基CSN1、CSN2、CSN3、CSN4、CSN7和CSN8含有PCI（Proteasome， COP9 signalosome and eIF3）結構域[7]。另外2個亞基CSN5和CSN6含有MPN（Mpr1-Pad1-N-terminal）結構域[6， 8]。在植物中，CSN一個主要的功能就是參與蛋白的降解。作為泛素-蛋白酶降解系統的組分，CSN通過移除cullin蛋白中的NEDD8（neural precursor cell- expre ssed developmentally downregulated-8，植物中也稱為RUB（RELATED TO UBIQU IT IN））來調控cullin- RING E3泛素連接酶的活性[8-12]。通過這種方式，CSN與SCF（SKP1-CUL1-F-box-type CRLs）復合體協作參與多種信號轉導過程，在植物的生長發育、次生代謝調控中起著重要的作用。如CSN與SCFTIR1互作參與植物生長素信號途徑[10， 13];CSN與SCFUFO互作參與花發育[14];CSN與SCFCOI1互作參與茉莉酸信號途徑[15-16];CSN與SCFSLY1互作參與赤霉素的信號途徑[17-18];CSN與SCFCFK1互作參與種子的發育[19]。

在天然橡膠生產中，人們通過有規律地重復切割橡膠樹樹干樹皮（割膠），切斷樹皮中的乳管，多次收集從乳管傷口處流出的乳汁狀的膠乳來提煉橡膠。割膠顯著促進橡膠樹膠乳的合成，割膠樹的膠乳內源茉莉酸含量顯著高于未開割樹，橡膠合成效率顯著高于未開割樹，外施茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）促進膠乳的生物合成，并鑒定了茉莉酸信號途徑的核心環節HbCOI1- HbJAZ3-HbMYC2及其對法尼基焦磷酸合酶和小橡膠粒子膜蛋白基因的轉錄調節[20]。這些結果表明，割膠促進橡膠生物合成與激活茉莉酸信號傳導途徑有密切聯系。為了進一步豐富和了解茉莉酸信號途徑在橡膠生物合成中的作用，本文克隆了COP9信號小體的8個CSN成員并進行了組織特異性表達分析及割膠和茉莉酸甲酯處理的基因表達模式。

1? 材料與方法

1.1? 植物材料及處理

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）為熱研73397品系，種植于中國熱帶農業科學院實驗場。組織特異性表達的樣品的采集：于同一天分別采集3株樹的樹皮、古銅期葉、淡綠期葉、成熟期葉、膠乳、雄花和雌花混合后置于液氮中用于RNA的提取。割膠處理樣品的采集：選取3株8 a樹齡的未開割樹，采用S/2 d/3（1/2樹圍，3 d 1刀）的割制進行連續割4刀，收集每刀的膠乳樣品于RNA提取液中用于RNA的提取。茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）處理樣品的采集：參照郝秉中等[21]的方法，用0.07% MeJA分別處理橡膠樹萌條第三伸長單位，于處理后2 h、4 h、8 h、1 d、2 d、3 d劃破受傷部位的樹皮采集膠乳，每一處理分別采集9株萌條的膠乳混合于RNA提取液中用于RNA的提取，對照為滅菌水處理萌條的膠乳樣品。

1.2? 方法

1.2.1? RNA的提取及cDNA的合成? 采用RNAprep Pure Plant Kit（天根生化科技（北京）有限公司，北京）提取不同組織樣品的RNA，并采用試劑盒附帶的DNase I進行痕量DNA的消化。采用NanoDrop 2000 （Thermo Fisher Scientific， USA） 測定RNA的濃度，并用RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit （Thermo Fisher Scientific， USA）對RNA進行反轉錄合成第一鏈cDNA。

1.2.2? HbCSN基因的克隆? 將擬南芥AtCSNs的序列同熱研8-79的轉錄組序列（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE59981.）[22]進行同源性比對，獲得8個HbCSNs的unigene序列。這8個unigene序列缺失5′端序列，HbCSN1、HbCSN2、HbCSN4和HbCSN6缺失3′端序列。為了獲得完整的全長cDNA序列，采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit （Clontech， USA）試劑盒對HbCSNs序列進行了RACE（rapid-amp lification of cDNA ends）實驗，引物如表1。對于5′-RACE，采用試劑盒附帶的5′-CDS primer A和SMARTer II A oligonucleotide對1 g總RNA進行反轉錄，獲得用于5′-RACE的cDNA。對于3′-RACE，采用3′-RACE CDS Primer A按照試劑盒說明對1 g總RNA進行反轉錄，獲得用于3′-RACE的cDNA。以獲得5′-RACE和3′-RACE cDNA為模板，采用PrimeSTAR Max Premix （TaKaRa， Dalian， China）進行5′和3′端序列的擴增。將獲得的5′和3′端序列與unigene序列進行拼接，并設計全長cDNA擴增引物（表1），進行PCR擴增驗證。

1.2.3? 生物信息學及進化樹分析? 采用NCBI網站上的ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/gorf.html）對獲得的HbCSNs全長cDNA進行開放閱讀框的預測，并翻譯成氨基酸。用Conserved Domain Search Service（http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行氨基酸保守結構域的預測。利用PSORT（http：// psort.hgc.jp/form.html）對氨基酸序列進行亞細胞定位預測。采用基因結構顯示在線系統GSDS2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）[23]對8個橡膠樹CSN成員進行基因結構分析。

從NCBI數據庫下載擬南芥的AtCSN蛋白序列，首先用Clustal W進行序列多重比對，再利用MEGA 4.0軟件，選擇neighbour-joining（NJ）模型，并進行1000次Bootstrap統計學檢驗，構建HbCSNs蛋白序列與擬南芥CSN蛋白的系統進化樹。采用ProtParam tool （http：//web.expasy.org/ protparam/）評估HbCSNs蛋白的分子量及理論等電點（pI）。

1.2.4? 熒光定量PCR分析? 不同組織樣品及不同處理樣品第一鏈cDNA稀釋10倍用作模板采用Maxima SYBR Green qPCR Master Mixes （Thermo Scientific Inc.， USA）試劑基于CFX384 System （Bio-Rad Laboratories Inc.， USA）平臺進行實時熒光定量PCR。10 μL反應體系中，包含1 μL模板、5 μL 2×SYBR Premix、10 μmol/L上游引物和下游引物（表1）各0.3 μL、滅菌水補足10 μL。每1個PCR反應重復3次，反應程序為：95 ℃預變性30 s;95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環;循環完后進行產物溶解曲線分析。利用CFX manager 3.0軟件自動進行基線和Cq值分析，以HbActin （GenBank HQ260674.1）作為內參基因[24-26]，采用CFX384系統中2ΔΔCq算法進行基因的相對定量表達分析。

1.3? 數據處理

采用one-way ANOVA對處理及對照進行差異顯著性分析。

2? 結果與分析

2.1? COP9家族基因HbCSNs的克隆及特征分析

通過比對分析，在橡膠樹熱研8-79中發現了8個匹配COP9家族基因的unigene，經過ORF（open reading frame）分析，發現這8個unigene不具有完整的閱讀框，因此進行了5′-RACE，3′-RACE分析，通過拼接及RT-PCR擴增測序驗證，獲得了8個具有完整閱讀框的COP家族基因，根據與擬南芥的同源性，我們將這8個成員

分別命名為HbCSN1～HbCSN8，并將HbCSN1～ HbCSN8的全長cDNA序列登陸NCBI，GenBank登錄號分別為KX156270～KX156277。以熱研73397的基因組中CSN基因序列為依據，采用GSDS2.0分析了HbCSN1～HbCSN8的基因結構，結果表明橡膠樹中的CSN基因家族成員的基因結構均是由多個外顯子及多個內含子組成（圖 1）。COP家族基因HbCSN1～HbCSN8的ORF長594～1320 bp，編碼197～439個氨基酸，蛋白質的分子量（molecular weight，MW）介于22.641～ 51.395 ku之間，理論等電點pI介于4.98～6.26之間。根據NCBI的CDD保守結構域預測顯示，HbCSN1、HbCSN2、HbCSN3、HbCSN4、HbCSN7和HbCSN8具有PCI結構域，HbCSN5和HbCSN6具有MPN結構域（表2）。HbCSNs蛋白序列的亞細胞定位預測結果顯示，HbCSN1、HbCSN2、HbCSN3被定位于細胞質內;HbCSN4和HbCSN6被定位于葉綠體中;HbCSN5和HbCSN7被定位于細胞核中;HbCSN8被定位于微體（過氧物酶體）中。

HbCSN1～HbCSN8與擬南芥CSN基因家族的同源性比對顯示，橡膠樹CSN與擬南芥CSN的同源性在65.97%～88.38%之間，其中HbCSN2與AtCSN2的同源性最高，達到88.38%;HbCSN3與AtCSN3的同源性最低，達到65.97%（表2）。進化樹分析顯示，HbCSN1～HbCSN8分別與擬南芥AtCSN1～AtCSN8蛋白的親緣關系較近，聚為一類（圖2）。

2.2? HbCSNs組織特異性表達分析

通過實時熒光定量PCR技術分析了8個HbCSNs基因在橡膠樹樹皮、不同發育時期的葉片、膠乳、雌花及雄花中的表達量。結果顯示，8個HbCSNs基因均能在樹皮、古銅期葉、淡綠期葉、成熟期葉、膠乳、雄花和雌花中檢測到表達，其中HbCSN1、HbCSN2、HbCSN3、HbCSN4、HbCSN6和HbCSN8基因在淡綠期葉片中的表達量最高，其次是成熟期葉片;HbCSN5在膠乳中的表達量最高，HbCSN7在成熟期葉片中的表達量最高（圖3）。

2.3? 割膠處理對膠乳中HbCSNs基因表達的影響

熒光定量PCR結果顯示，HbCSN1、HbCSN3、HbCSN4、HbCSN5、HbCSN7和HbCSN8基因的表達量在割膠后顯著上調，其中HbCSN1、HbCSN3、HbCSN4、HbCSN7和HbCSN8基因第2、3、4刀的表達量與第1刀相比，表達量的上升達到極顯著水平;HbCSN5基因第3、4刀的表達量與第1刀相比，表達量的上升達到極顯著水平。相反，HbCSN6基因的表達量在割膠的第2、3刀后顯著下調。HbCSN2基因的表達量不受割膠的影響（圖4）。

2.4? 外施茉莉酸甲酯（MeJA）處理對膠乳中HbCSNs基因表達的影響

熒光定量表達分析顯示，除了HbCSN2和HbCSN7的表達不受MeJA處理的外，其他6個HbCSNs基因的表達量在不同處理時間表達上調，其中HbCSN1、HbCSN3、HbCSN6和HbCSN8基因的表達在MeJA處理8 h后顯著上調，1 d后達到最高，在2 d后降下來。而且，HbCSN1的基因表達量上升的幅度最大，MeJA處理8 h和1 d后的表達量約是對照的2倍。HbCSN4和HbCSN5基因分別在MeJA處理1 d和4 h后上調表達（圖5）。

3? 討論

氨基酸序列比對及系統進化分析表明，橡膠樹HbCSN1～HbCSN8與擬南芥AtCSNs相似，其中HbCSN1、HbCSN2、HbCSN3、HbCSN4、HbCSN7、HbCSN8分別和AtCSN1、AtCSN2、AtCSN3、AtCSN4、AtCSN7、AtCSN8結構相似，均具有PCI結構域;HbCSN5、HbCSN6分別和AtCSN5、AtCSN6結構相似，均具有MPN結構域。PCI結構域對于COP9蛋白復合體的組裝是必須的，這是因為PCI結構域介導了多亞基復合物中蛋白與蛋白互作的穩定性[27-28]。MPN結構域可以細分為具有生物活性的MPN+和無活性的MPN[29]。CSN5含有MPN+結構域，該結構域具有一個嵌入式的金屬蛋白酶基序JAMM（Jab1/ MPN/Mov24），JAMM基序作為CSN異肽酶的催化中心起作用[1， 9， 30-32]。CSN6含有非活性MPN結構域，缺少JAMM基序，但是可能參與調控JAMM活性[33-34]。橡膠樹HbCSNs與擬南芥的AtCSNs具有相似的結構域，可能具有與擬南芥相似的功能。

Feng等[15]采用免疫共沉淀和凝膠過濾分析在擬南芥體內證實CSN3、CSN4、CSN5和CSN6與SCFCOI1具有直接的聯系，基因組表達圖譜分析表明，JA引發的基因組表達在很大程度上依賴于COI1的劑量，更重要的是COI1依賴性JA應答基因要求CSN起作用，而且CSN的豐度對于JA響應具有重要的作用，據此推測CSN與SCFCOI1在體內相互作用介導JA的響應。本研究中，MeJA處理能顯著上調HbCSN1、HbCSN3、HbCSN4、HbCSN5和HbCSN8基因的表達豐度，HbCSNs表達豐度的上調是否也與JA的響應相關還需要進一步的研究。CSN不僅參與調節茉莉酸的響應，可能還參與調控茉莉酸的合成和植物應對食草動物及病原體的傷害[35]。在擬南芥，一種具有環狀單鏈基因組DNA的雙生病毒，通過CSN介導的SCF E3連接酶復合體的脫氫化抑制JA信號[16]。因此，CSN基因可能介導JA信號反應調控植物的發育和防衛反應。在本研究中，橡膠樹8個CSN基因在多個組織中均能檢測到表達，表明CSN可能參與了多種生理及發育的進程。在膠乳中，HbCSN1、HbCSN3、HbCSN4、HbCSN5和HbCSN8表達受割膠和MeJA處理顯著上調。這些基因的表達模式與JA信號途徑相關成員HbCOI1[36]、HbJAZ1[37]和HblMYC1[23]的表達模式相似。而且，有證據表明割膠和JA處理與天然橡膠的生物合成顯著相關[20， 38]，由此推測CSN可能參與膠乳的JA信號途徑，但是其具體的機制還有待于進一步的研究。

參考文獻

Wei N， Serino G， Deng X W. The COP9 signalosome： more than a protease[J]. Trends in Biochemical Sciences， 2008， 33（12）： 592-600.

Stratmann J W， Gusmaroli G. Many jobs for one good cop- the COP9 signalosome guards development and defense[J]. Plant Science， 2012， 185-186： 50-64.

Wei N， Deng X W. COP9： a new genetic locus involved in light-regulated development and gene expression in Arabi dopsis[J]. Plant Cell， 1992， 4（12）： 1507-1518.

Wei N， Chamovitz D A， Deng X W. Arabidopsis COP9 is a component of a novel signaling complex mediating light control of development[J]. Cell， 1994， 78（1）： 117-124.

Chamovitz D A， Wei N， Osterlund M T， et al. The COP9 complex， a novel multisubunit nuclear regulator involved in light control of a plant developmental switch[J]. Cell， 1996， 86（1）： 115-121.

Wei N， Deng X W. The COP9 signalosome[J]. Annual Re view of Cell and Developmental Biology， 2003， 19： 261-286.

Hofmann K， Bucher P. The PCI domain： a common theme in three multiprotein complexes[J]. Trends in Biochemical Sciences， 1998， 23（6）： 204-205.

Cope G A， Suh G S， Aravind L， et al. Role of predicted met alloprotease motif of Jab1/Csn5 in cleavage of Nedd8 from Cul1[J]. Science， 2002， 298（5593）： 608-611.

Lyapina S， Cope G， Shevchenko A， et al. Promotion of NEDD-CUL1 conjugate cleavage by COP9 signalosome[J]. Science， 2001， 292（5520）： 1382-1385.

Schwechheimer C， Serino G， Callis J， et al. Interactions of the COP9 signalosome with the E3 ubiquitin ligase SCFTIRI in mediating auxin response[J]. Science， 2001， 292（5520）： 1379-1382.

Groisman R， Polanowska J， Kuraoka I， et al. The ubiquitin ligase activity in the DDB2 and CSA complexes is differentially regulated by the COP9 signalosome in response to DNA damage[J]. Cell， 2003， 113（3）： 357-367.

Pintard L， Kurz T， Glaser S， et al. Neddylation and deneddylation of CUL-3 is required to target MEI-1/Katanin for degradation at the meiosis-to-mitosis transition in C. elegans[J]. Current Biology， 2003， 13（11）： 911-921.

Stuttmann J， Lechner E， Guerois R， et al. COP9 signalo some-and 26S proteasome-dependent regulation of SCFTIR1 accumulation in Arabidopsis[J]. Journal of Biological Chemistry， 2009， 284（12）： 7920-7930.

Wang X， Feng S， Nakayama N， et al. The COP9 signalosome interacts with SCFUFO and participates in Arabidopsis flower development[J]. Plant Cell， 2003， 15（5）： 1071-1082.

Feng S， Ma L， Wang X， et al. The COP9 signalosome interacts physically with SCFCOI1 and modulates jasmonate responses[J]. Plant Cell， 2003， 15（5）： 1083-1094.

Lozano-Duran R， Rosas-Diaz T， Gusmaroli G， et al. Geminiviruses subvert ubiquitination by altering CSN-mediated derubylation of SCF E3 ligase complexes and inhibit jasmonate signaling in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Cell， 2011， 23（3）： 1014-1032.

Dohmann E M， Nill C， Schwechheimer C. DELLA proteins restrain germination and elongation growth in Arabidopsis thaliana COP9 signalosome mutants[J]. European Journal of Cell Biology， 2010， 89（2-3）： 163-168.

Jin D， Wu M， Li B， et al. The COP9 Signalosome regulates seed germination by facilitating protein degradation of RGL2 and ABI5[J]. PLoS Genetics， 2018， 14（2）： e1007237.

Franciosini A， Lombardi B， Iafrate S， et al. The Arabidopsis COP9 SIGNALOSOME INTERACTING F-BOX KELCH 1 protein forms an SCF ubiquitin ligase and regulates hypoc otyl elongation[J]. Molecular Plant， 2013， 6（5）： 1616- 1629.

Deng X， Guo D， Yang S， et al. Jasmonate signalling in the regulation of rubber biosynthesis in laticifer cells of rubber tree， Hevea brasiliensis[J]. Journal of Experimental Botany， 2018， 69（15）： 3559-3571.

Hao B Z， Wu J L. Laticifer differentiation in Hevea brasiliensis： induction by exogenous jasmonic acid and linolenic acid[J]. Annals of Botany， 2000， 85： 37-43.

Chao J Q， Chen Y Y， Wu S H， et al. Comparative transcrip tome analysis of latex from rubber tree clone CATAS8-79 and PR107 reveals new cues for the regulation of latex regeneration and duration of latex flow[J]. BMC Plant Biology， 2015， 15： 104. doi： 10.1186/s12870-015-0488-3.

Hu B， Jin J P， Guo A Y， et al. GSDS 2.0： an upgraded gene feature visualization server[J]. Bioinformatics， 2015， 31（8）： 1296-1297.

Zhao Y， Zhou L M， Chen Y Y， et al. MYC genes with differential responses to tapping， mechanical wounding， ethephon and methyl jasmonate in laticifers of rubber tree （Hevea brasiliensis Muell. Arg.）[J]. Journal of Plant Physiology， 2011， 168（14）： 1649-1658.

Wang Y， Guo D， Li H L， et al. Characterization of HbWRKY1， a WRKY transcription factor from Hevea bra siliensis that negatively regulates HbSRPP[J]. Plant Physi ology Biochemistry， 2013， 71： 283-289.

Li H L， Guo D， Yang Z P， et al. Genome-wide identification and characterization of WRKY gene family in Hevea brasil iensis[J]. Genomics， 2014， 104（1）： 14-23.

Kapelari B， Bech-Otschir D， Hegerl R， et al. Electron mi croscopy and subunit-subunit interaction studies reveal a first architecture of COP9 signalosome[J]. Journal of Molecular Biology， 2000， 300（5）： 1169-1178.

Tsuge T， Matsui M， Wei N. The subunit 1 of the COP9 sig nalosome suppresses gene expression through its N-terminal domain and incorporates into the complex through the PCI domain[J]. Journal of Molecular Biology， 2001， 305（1）： 1-9.

Nezames C D， Deng X W. The COP9 signalosome： its regulation of cullin-based E3 ubiquitin ligases and role in photomorphogenesis[J]. Plant Physiology， 2012， 160（1）： 38-46.

Maytal-Kivity V， Reis N， Hofmann K， et al. MPN+， a putative catalytic motif found in a subset of MPN domain proteins from eukaryotes and prokaryotes， is critical for Rpn11 function[J]. BMC Biochemistry， 2002， 3： 28.

Tran H J， Allen M D， Lowe J， et al. Structure of the Jab1/ MPN domain and its implications for proteasome function[J]. Biochemistry， 2003， 42（39）： 11460-11465.

Ambroggio X I， Rees D C， Deshaies R J. JAMM： a metallo protease-like zinc site in the proteasome and signalosome[J]. PLoS Biology， 2004， 2（1）： E2.

Kotiguda G G， Weinberg D， Dessau M， et al. The organi zation of a CSN5-containing subcomplex of the COP9 signalosome[J]. Journal of Biology Chemistry， 2012， 287（50）： 42031-42041.

Jin D， Li B， Deng X W， et al. Plant COP9 signalosome subunit 5， CSN5[J]. Plant Science， 2014， 224： 54-61.

Hind S R， Pulliam S E， Veronese P， et al. The COP9 signalo some controls jasmonic acid synthesis and plant responses to herbivory and pathogens[J]. Plant Journal， 2011， 65（3）： 480- 491.

Peng S Q， Xu J， Li H L， et al. Cloning and molecular char acterization of HbCOI1 from Hevea brasiliensis[J]. Biosci ence Biotechnology and Biochemistry， 2009， 73（3）： 665-670.

Tian W M， Huang W F， Zhao Y. Cloning and character iza tion of HbJAZ1 from the laticifer cells in rubber tree （Hevea brasiliensis Muell. Arg.）[J]. Trees， 2010， 24： 771-779.

Liu J P， Hu J， Liu Y H， et al. Transcriptome analysis of Hevea brasiliensis in response to exogenous methyl jas monate provides novel insights into regulation of jas monate-elicited rubber biosynthesis[J]. Physiology and Mo lecular Biology of Plants， 2018， 24（3）： 349-358.