基于GC－MS研究不同產地三色藜麥種子的代謝物差異

時羽杰 李興龍 唐媛 董雨 鄔曉勇

摘要：為了研究不同生境對藜麥發育的影響，以不同產地的藜麥種子為研究對象，篩選顯著差異代謝物質和相關代謝通路，利用GC-MS平臺進行非靶向代謝組學分析，分析了青海都蘭縣和四川鹽源縣兩地產出的黑藜、紅藜、白藜種子的代謝輪廓，將原始數據經XCMS online平臺預處理后進行后續多元統計分析。結果表明，青海都蘭縣和四川鹽源縣兩地的黑、紅、白藜麥種子的代謝特征均不相同，其中紅藜麥種子與白藜麥種子差異較大，而黑藜麥種子差異最小;紅藜存在顯著差異，共有特征峰570個，上調物少于下調物;黑藜差異最小，上、下調趨勢與紅藜一致;白藜差異較大，上、下調趨勢與紅藜和黑藜相反，共有特征峰486個，上調物質多于下調物質;不同生境對藜麥的影響較大，黑藜和紅藜更適宜在青海都蘭縣種植，而白藜更適宜在四川鹽源縣種植。研究結果可以指導青海都蘭縣和四川鹽源縣兩地藜麥的栽培育種，也為深入研究藜麥的抗逆性機理提供了理論依據。

關鍵詞：作物栽培學;藜麥;GC-MS;XCMS;代謝差異;抗逆性

中圖分類號：TS210.1文獻標志碼：A

Abstract：In order to study the effects of different habitats on the development of quinoa， taking quinoa seeds from different habitats as research objects， significant differences in metabolites and related metabolic pathways are screened. The metabolic profiles of the seeds of black quinoa， red quinoa and white quinoa from Dulan County， Qinghai Province and Yanyuan County， Sichuan Province are analyzed through non-targeted metabonomics analysis with GC-MS platform. The original data are pretreated by XCMS online platform for subsequent multivariate statistical analysis. The results show that the metabolic characteristics of black， red and white seeds in Dulan county and Yanyuan County are different. Among them， the difference between red and white seeds from the two counties is larger， while the difference of the black quinoa seeds is the smallest. There are 570 characteristic peaks in red seeds which have significant differences， and the up-regulated substances are less than the down-regulated. The difference between black quinoa from two habitats is the smallest， and the up- and down-regulated trends are like that of red quinoa. There is secondly significant difference between the white seeds from the two habitats， and the up- and down-regulated trends are the opposite of that of the red and black quinoas， and 486 characteristic peaks are detected， with more up-regulated substances than down-regulated. Different habitats have great impact on quinoa. Black and red quinoas are more suitable to be planted in Dulan County， Qinghai Province， while white quinoa is more suitable to be planted in Yanyuan County， Sichuan Province. The conclusions could guide the cultivation and breeding of quinoa in Dulan county and Yanyuan County， and provide theoretical basis for further study of the stress resistance mechanism of quinoa.

Keywords：crop cultivation;quinoa;GC-MS;XCMS;metabolic differences;stress resistance

代謝組學（metabonomics/metabolomics）是繼基因組學、蛋白組學之后又一門新興的學科，是系統生物學的重要組成部分，旨在研究生物體或組織，甚至單個細胞的全部小分子代謝物（MV<1 000）成分及其動態變化[1]，根據分析目的的不同又可以分為靶向代謝組學和非靶向代謝組學。靶向代謝組學主要針對幾種目標化合物或某條通路上涉及的部分代謝物，利用標準品，構建特異性強、靈敏度高、重復性好的檢測方法，對目標物質進行分析。非靶向代謝輪廓分析方法面向所有能檢測到的化合物，可以較全面地反映整體代謝狀態的變化，并通過多元統計分析篩選差異代謝物，對差異代謝物進行通路分析，揭示其變化的生理機制，在轉基因植物非預期效應研究[2]、非生物與生物脅迫研究中顯示出了極大的潛力。

藜麥，古代印加人稱之為“糧食之母”[3]。藜麥含有蛋白質、礦物質、氨基酸、纖維素、維生素等營養成分，含量明顯高于大多數常見谷物[4]。聯合國糧農組織于2013年正式將藜麥推薦為最適宜人類的“全營養食品”[5]。藜麥還含有豐富的多酚類、黃酮類、皂苷等活性成分[6]，具有耐寒、耐旱、耐瘠薄、耐鹽堿等生理特點。藜麥種子主要有白、黑、紅、黃等幾種顏色系，營養品質差異較大，藜麥中含有生物堿、多酚等物質。黑藜中總多酚的含量最高，明顯高于紅藜和白藜，而紅藜和白藜中總多酚含量差異不大[7]。趙亞東[8]研究發現青海的不同色系藜麥中，紅藜含皂苷最多，抗氧化性極強，白藜抗氧化性最弱。這些研究均表明，藜麥的生境對籽粒發育影響顯著。鑒于目前國內從代謝組學方面對不同產地藜麥的研究甚少，本研究主要以非靶向代謝組學研究青海都蘭縣和四川鹽源縣兩地的黑、白、紅藜麥，以獲取較為全面的代謝物質信息，全面、準確地分析其差異物質和代謝通路，分析3種藜麥種子代謝物在不同生境下的異同，為揭示藜麥在不同栽培地區造成的差異等后續研究提供理論依據，指導藜麥的耕作與栽培。

1主要材料與儀器

1.1材料

分別選2018年采收自青海省海西蒙古族藏族自治州都蘭縣（平均海拔3 000 m）和四川省涼山州的鹽源縣（平均海拔2 000 m）的黑、紅、白色藜麥種子，經發芽試驗篩選，取發芽率和發芽勢相同的一批進行實驗，每一個樣品均重復6次。文中所提到的青海都蘭縣黑藜、紅藜、白藜均以A，C，E表示，四川鹽源縣黑藜、紅藜、白藜均以B，D，F表示。

1.2試劑

核糖醇，甲氧氨基鹽酸鹽，N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA），購自Sigma Aldrich公司;吡啶，甲醇，氯仿，三甲基氯硅烷均為色譜純，成都科隆化學品有限公司提供。

1.3儀器

Agilent GC-MS 7890B 5977氣質聯用儀，產地美國;DB-5MS毛細管氣相色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），購自安捷倫公司（美國）;THZ-82水浴恒溫振蕩器，常州榮華儀器制造有限公司提供;通風櫥、H1850R臺式高速冷凍離心機，產地湖南;ZLS-2真空離心濃縮儀，湖南赫西儀器有限公司提供。

2實驗方法

2.1樣品制備

分別取來自青海都蘭縣和四川鹽源縣兩地的黑、紅、白藜麥種子，參考LISEC等[9]的研究方法對植物樣本進行提取，條件稍作優化。對樣品進行6次生物學重復，并做質控樣本QC，QC樣本是將所有提取物的均等混合樣隨機插入檢測的樣本序列中，主要用于實驗方法和儀器穩定的校正。將所有樣品置于EP管，于真空離心濃縮儀中進行揮干備用。

2.2樣品衍生化

在上述干燥后的樣品管中加入60 μL甲氧氨基鹽酸鹽（20 mg/mL吡啶溶液），于37 ℃振蕩反應2 h。反應完畢后再加入100 μL的N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺和1%（體積分數，下同）三甲基氯硅烷（MSTFA+1%TMCS），于37 ℃振蕩反應30 min。將衍生化完成后的樣品用0.22 μm濾膜過濾[10]后轉移至適合GC-MS分析的內襯管中。

2.3GC-MS分析條件

2.3.1色譜條件

采用DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）毛細管氣相色譜柱;升溫程序：起始溫度保持在80 ℃，2 min后以10 ℃/min升至190 ℃，再以3 ℃/min升至220 ℃，最后以20 ℃/min升至280 ℃，保持10 min;載氣：氦氣（體積分數為99.999%）;恒流，流速為1 mL/min;進樣模式：不分流進樣，進樣量為1 μL。

2.3.2質譜條件

電子碰撞內能：70 eV;離子源溫度：220 ℃;傳輸線溫度：270 ℃;注射劑溫度：280 ℃;掃描速度：每20 s光譜全波段掃描法捕獲;溶劑延遲：420 s;質量掃描范圍m/z：70～500。

2.4數據處理

將GC-MS原始數據[11]上傳至XCMS online程序，進行行峰識別（peaks identification）、峰過濾（peaks filtration）、峰對齊（peaks alignment）等[12]，同時設置相應參數[13]，最后得到包括質核比（m/z）和保留時間（rt）及峰面積等信息的數據矩陣。將數據導出至Excel進行后續整理，用SIMCA-P（v14.0） 軟件進行主成分分析（PCA）和正交-偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），結合XCMS分析篩選差異代謝物，進行后續的差異代謝物統計分析。

3結果與分析

3.1主成分分析

原始數據經XCMS進行峰識別、過濾、對齊等處理后，結果見圖1。將處理后的數據整理后導入SIMCA-P軟件中進行主成分分析（PCA），用UV處理數據進行擬合，擬合后方程的R2X=0.855>0.5，說明擬合性好，且Q2=0.648，與R2X相差較小，說明擬合方程的穩定性好。圖2為得到的PCA得分，由圖2可知，QC的重復樣本間較為聚集，說明實驗方法和檢測儀器較為穩定，準確性較好。此外，6組樣品中除了B6，D3和E3外的所有點基本都處在95%的置信區間內，且每一組內的重復樣品較為聚集，而各組間的樣品又相對較為分散，組與組之間有明顯的界限，說明樣品組內的重復性好，數據較為準確;而樣品組間的明顯界限說明，各組間存在著明顯的差異。還可以看出，在A組、C組、E組間，A組與C組、E組在第一主成分上被明顯分開，其中A組被分在了第一主成分的左邊，而C組和E組被分在了第一主成分的右邊，說明A組與C組、E組間差異較大，C組和E組間差異較小。B組、D組、F組間也存在著一樣的差異趨勢，說明同一產地的不同色系藜麥間也存在著明顯差異。用DModX和置信區間進行初步篩選，剔除B6，D3，E2這3個異常點[14]，以保證后續數據分析的準確性。

PCA只能反映樣品的整體趨勢，不利于發現組間差異和差異化合物，所以需要通過正交-偏最小二乘法判別（OPLS-DA）來更為準確地分析數據，尋找組間的差異[15]。首先根據種子顏色進行分組：A-B組、C-D組和E-F組，用Par算法進行數據轉換，用OPLS-DA方程進行擬合，得到擬合方程的模型參數見表1。其中所有的R2X，R2Y和Q2都大于0.5且各參數間差異較小，說明擬合方程較為可靠。由方程擬合得到OPLS-DA得分圖，見圖3中的a），b）和c）。由圖3可知，A-B組、C-D組和E-F組的分離程度較大，說明各組間有明顯差異，且組內點相對較為聚集，表明樣品間重復性好且較為穩定。再經過OPLS-DA置換檢驗來判斷方程是否過擬合，得到檢驗圖（見圖3中的d），e）和f））。圖3中所有的Q2點從左到右均低于最右邊的原始Q2點，且Q2<0，R2和Q2的回歸線與橫坐標交叉或者小于0，說明評估模型可靠有效[16]。

3.3篩選顯著性差異代謝物

采用XCMS的Pairwise中的對比分析，上傳A-B組、C-D組和E-F組數據進行分組分析處理，得到Metabolomic Cloud Plot圖，設置參數p-value<0.01，fold change>1.5，進行顯著性差異代謝物的篩選，得到代謝物的云圖，見圖4。圖中M線上部為上調，M線下部為下調，橫坐標為保留時間，縱坐標是m/z。圖4顯示，A-B組有140個差異代謝物，上調的有90個，下調的有50個;C-D組有570個差異代謝物，上調的有209個，下調的有361個;E-F組有486個代謝物，上調的有379個，下調的有107個。其中A-B組中上調物質占總物質的64.28%，下調物質占35.72%;E-F組中上調物質占總物質的77.98%，下調物質占總物質的22.02%，兩組趨勢和比例相差不大。C-D組中，上調物質占總物質的36.67%，下調物質占總物質的6333%，與A-B組和E-F組完全相反。其中C-D組間差異物質最多，差異最大，這一結果也與胡一晨等[7]的報道一致。

3.4差異代謝物通路分析

將上述篩選鑒定的差異代謝物上傳至Metaboanalyst，利用MetPA數據庫對其進行超幾何檢驗和拓撲結構分析，根據代謝通路的濃縮，識別出可能的受生物擾動的代謝通路[17]。對差異代謝物和通路進行相關性分析，得到多條相關通路。根據-log p值和Impact值綜合分析，每一組篩選出最為顯著的2條代謝通路，如表2所示。

由表2可知，黑藜中主要是吲哚生物堿合成途徑，合成的生物堿可以降血糖和血脂，有效治療糖尿病，與房娜[18]的研究結果一致;泛酸與CoA生物合成途徑與植物的碳水化合物、脂肪酸、蛋白質和能量代謝密切相關。紅藜中主要是硫代謝途徑，它與植物抗逆性密切相關，其途徑中SO2-4經過植物一系列還原與同化反應后進入有機骨架，生成半胱氨酸（Cys），植物再以Cys為前體，合成眾多具有重要生物學功能的代謝產物，直接關系到植物耐逆境脅迫和農作物的產量與品質，苯丙氨酸代謝途徑與植物的防御系統密切相關。白藜中主要是谷胱甘肽代謝途徑，它與植物直接和間接的抗逆功能活動密切相關[19];丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑與糖代謝密切相關。

4討論與結論

青海省海西蒙古族藏族自治州都蘭縣是典型的高原大陸性氣候，日照時間長，太陽輻射強，晝夜溫差大，常年干旱、多風、少雨，年平均氣溫4 ℃左右;而四川省涼山州鹽源縣的日溫差較大，年均氣溫12.1 ℃，最高溫度30.7 ℃，最低溫度-11.3 ℃;雖然兩地都較適宜藜麥的種植，但不同藜麥品種間的適應性不同。

本研究對青海都蘭縣和四川鹽源縣兩地的黑、紅、白藜麥種子做了代謝組學分析，發現兩地種子之間都存在著明顯差異，其中紅藜麥種子與白藜麥種子差異較大，而黑藜麥種子差異最小。差異物質主要是脂肪酸（棕櫚酸、肉桂酸、油酸）、糖類（乳糖、葡萄糖、脫氧糖苷）和氨基酸（脯氨酸、絲氨酸、組氨酸）等。通過比較發現，四川鹽源縣與青海都蘭縣的黑藜相比，差異代謝物纈氨酸表達下調，而纈氨酸是合成α-酮異戊酸的前體，α-酮異戊酸在酶作用下生成酮泛解酸，再與β-Ala合成泛酸。纈氨酸的下調導致泛酸合成受阻，使得植物體的碳水化合物、脂肪酸、蛋白質和能量代謝受阻。四川鹽源縣和青海都蘭縣的紅藜相比，差異代謝物O-Acetylserine表現為顯著下調，而這與半胱氨酸（Cys）密切相關。O-Acetylserine是Cys合成的前體，Cys合成受阻會導致硫代謝受阻。這些結果均表明，青海都蘭縣的黑藜與紅藜均比四川鹽源縣有較強的耐受性，均能通過調節體內能量代謝通路的變化更好地去適應青海相對低溫的生境。而四川鹽源縣和青海都蘭縣的白藜相比，差異代謝物谷胱甘肽（還原型）表達上調。因為谷胱甘肽有很強的抗氧化性，其上調增加直接影響到植物的抗逆性，使得四川鹽源縣的白藜能更快地通過代謝通路的變化去消除體內過氧化物以及自由基等，使藜麥進行正常的生長，因此四川鹽源縣的白藜比青海都蘭縣的白藜有更好的適應性，而這一研究結果也與青海都蘭縣白藜麥栽培的結果一致——溫度的變化會導致白藜生長緩慢[21]。

本實驗通過代謝組學分析四川鹽源縣與青海都蘭縣的黑、紅、白藜，發現兩地的同種藜麥間代謝物質有很大差異。在此基礎上通過分析差異代謝物的代謝通路，發現青海都蘭縣的黑藜和紅藜比四川鹽源縣具有更好的抗逆性，而青海都蘭縣的白藜較四川鹽源縣的白藜抗逆性弱。抗氧化性與抗逆性密切相關，這與趙亞東等[22]的研究結果一致。所以紅藜和黑藜更適宜在青海都蘭縣種植，而白藜更適宜在四川鹽源縣種植。研究結果可為后續在代謝途徑層面上深入研究藜麥的抗逆性機理提供理論依據。

本研究所選取的樣本種類過少，在對不同生境下藜麥種子進行分析時只進行了代謝層面的分析，缺少對通路中關鍵蛋白質和關鍵酶的分析，對整個機理的解釋存在著一定局限性。后續將結合多組學技術包括基因組學、轉錄組學和蛋白質組學等，對不同生境下黑、紅、白藜麥的差異進行更加全面深入的分析，以期選育出優質、高產、抗逆性強的藜麥新品種，為藜麥的栽培種植提供理論依據。

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