柚樹高產(chǎn)栽培技術(shù)（系列）V：黃龍病的識別與防治

楊德榮 曾志偉 周龍

摘? ?要? ?黃龍病一直危害著柑橘生產(chǎn)，做好黃龍病的識別和防治是柚子生產(chǎn)中的一項(xiàng)重要任務(wù)。亞洲柑橘木虱和非洲木虱是黃龍病傳播的主要媒介，科學(xué)適量釋放捕食性天敵瓢蟲等，與化學(xué)防治相結(jié)合可有效防控木虱。對于疑似黃龍病病株，可采取簡易的“黃龍病檢測試劑”檢測，該方法簡單易行、成本低廉、準(zhǔn)確率高，對于普通種植戶是經(jīng)濟(jì)可行的識別方法。

關(guān)鍵詞? ?柚樹;柑橘黃龍病;識別與鑒定;防治措施

中圖分類號：S436.661.1? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.1.012

柑橘黃龍病在我國最早發(fā)現(xiàn)，萊因金（Reinking）1919年記述了華南柑橘上的一種黃葉斑駁病。陳其暴1943年首次報(bào)道，柑橘黃龍病于1938—1941年在廣東潮汕地區(qū)嚴(yán)重發(fā)生，因廣東潮汕地區(qū)稱梢為“龍”，故得名黃龍病[1]。我國植物病理學(xué)家林孔湘教授首次證實(shí)該病害是一種傳染性病害[2]。1995 年，在中國福州舉行的第13屆國際柑橘病毒學(xué)家會議（International Organization of Citrus Virologists， IOCV）正式將黃龍病命名為“Huanglongbing”，簡稱HLB，而將國外曾經(jīng)使用的“柑橘青果病（Citrus greening）”等作為地方名稱[3]。

專家們研究發(fā)現(xiàn)，甜橙、橘等為黃龍病高感品種，柚類屬于中感品種[1]。盡管如此，黃龍病對柚子產(chǎn)業(yè)的危害仍然非常巨大。筆者通過對云南省瑞麗市柚子種植大戶的調(diào)研發(fā)現(xiàn)，一定規(guī)模以上柚子地塊，均出現(xiàn)黃龍病病株或疑似黃龍病癥狀病株。柚樹感染黃龍病后，全年均可表現(xiàn)癥狀，在柚園抽發(fā)夏梢和秋梢期間發(fā)病最多，其次是春梢。發(fā)病伊始，柚樹新梢葉停止轉(zhuǎn)綠，在樹冠頂部出現(xiàn)明顯的“黃梢”現(xiàn)象。葉片呈現(xiàn)斑駁型或花葉型黃化，其中斑駁型黃化最為典型，黃化癥狀從葉脈基部和側(cè)脈附近出現(xiàn)，然后逐漸擴(kuò)展形成不規(guī)則、大小不一、形狀各異的斑駁型黃斑。柚樹一旦感染黃龍病，輕者影響產(chǎn)量和品質(zhì)，重者將造成“樹死園毀”。田間農(nóng)事作業(yè)中，黃龍病的癥狀常常與柚園管理不善造成的現(xiàn)象相近，普通農(nóng)戶難以有效甄別。再者，由于時間、費(fèi)用等諸多因素的限制和影響，幾乎無法做到將樣本送到高等院校和研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行鑒定。由此可見，對黃龍病的識別和防治非常重要。筆者從實(shí)際生產(chǎn)出發(fā)，討論一種適宜柚樹種植普通農(nóng)戶應(yīng)用的黃龍病識別和防治方法，希望對柚子種植戶有一定的幫助。

1 黃龍病病原菌及其寄主

1.1 黃龍病病原菌

人類對柑橘黃龍病病原菌的認(rèn)知經(jīng)歷了“病原生理因子、病毒階段”“病原類菌原體、類立克次氏階段”“病原類細(xì)菌階段”，直到1984年，Garnier等通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)黃龍病病原的膜結(jié)構(gòu)外壁和內(nèi)壁間存在肽聚糖，與革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相似，故認(rèn)為黃龍病病原是一種革蘭氏陰性細(xì)菌[4]。1995年，黃龍病病原歸為候選的薄壁菌門韌皮部桿菌屬（Candidatus liberibacter sp），屬于真細(xì)菌的變形菌綱（ Proteobacteriacea）α亞綱成員。根據(jù)黃龍病病原物對熱的敏感性、蟲媒和地理分布，將其分為3個種：亞洲種（Candidatus liberibacter asiaticus，Las），其傳媒昆蟲為亞洲柑橘木虱（Diaphorina citri）;非洲種（Candidatus liberibacter africanus，Laf），其傳媒昆蟲為非洲柑橘木虱（Trioza erytreae）;美洲種（Candidatus liberibacter americanus，Lam），其傳媒昆蟲為亞洲柑橘木虱（Diaphorina citri）。Las屬于耐熱型，發(fā)病的適合溫度為27～32 ℃，常在低海拔炎熱地區(qū)存在;Laf屬于熱敏感型，發(fā)病適合溫度為22～25 ℃，只能在海拔700 m以上地區(qū)種植的柑橘上發(fā)現(xiàn);Lam也屬于耐熱型，發(fā)病適合溫度為27～32 ℃，在癥狀表現(xiàn)上更接近于亞洲種[5]。

1.2 黃龍病發(fā)生與流行規(guī)律

黃龍病傳播途徑主要是通過帶病接穗、苗木及柑橘木虱蟲媒進(jìn)行傳播，也可通過草地菟絲子（Cuscuta chinensis）將黃龍病菌從柑橘傳到草本植物長春花（Catharanthus roseus）上。病原菌主要在田間韌皮部組織中越冬，初侵染源為田間病株、帶菌苗木及帶菌柑橘木虱。

在田間傳播黃龍病的柑橘木虱主要是亞洲柑橘木虱和非洲木虱，二者喜食嫩芽，卵大多產(chǎn)在嫩葉邊緣，若蟲生活在葉子邊緣的背側(cè)或者葉脈和葉柄部。非洲木虱的若蟲會植入葉片背部形成凹巢，有突起狀，當(dāng)成長為成蟲后，巢空，突起狀仍在。而亞洲柑橘木虱一般不會產(chǎn)生突起狀，但嚴(yán)重時葉片扭曲[6]。

1.3 黃龍病寄主

柑橘黃龍病的植物寄主主要是柑橘屬及蕓香科柑橘亞科近緣屬植物。除蕓香科植物外，柑橘黃龍病細(xì)菌還可以通過菟絲子傳播給長春花、煙草和番茄等非蕓香科植物。長春花染病后的癥狀比柑橘更明顯，病菌密度更高，因此，常被用作黃龍病草本指示植物[1， 5]。

2 柚樹黃龍病的識別方法

2.1 田間識別法

田間識別法主要是依據(jù)新梢的成熟期癥狀表現(xiàn)來識別黃龍病，如果當(dāng)年新梢出現(xiàn)黃梢和葉片出現(xiàn)斑駁癥狀，很多種植戶基本上會把該柚樹判定為疑似黃龍病病樹。但是由于黃龍病的癥狀很容易和其他由于管理不善、營養(yǎng)不良或病蟲害引起的癥狀相混淆，特別是已經(jīng)感染黃龍病但尚未表現(xiàn)明顯癥狀的植株難以依據(jù)癥狀做出準(zhǔn)確的判定。

2.2 實(shí)驗(yàn)室鑒定法

實(shí)驗(yàn)室判定法是研究、檢疫黃龍病的主要方法，經(jīng)過柑橘學(xué)者多年的研究，先后報(bào)道了電鏡觀察法、血清學(xué)診斷法、核酸探針雜交法及PCR擴(kuò)增法[3， 6]。但是由于時間、費(fèi)用等因素，在實(shí)際生產(chǎn)中，柚樹種植戶幾乎不會送樣本到高等院校和科研院所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室判定。

1）電鏡觀察法。電鏡觀察可以把黃龍病菌的形態(tài)、大小及細(xì)菌體的壁膜結(jié)構(gòu)等特征觀察清楚，做出的診斷非常準(zhǔn)確，是一種重要的鑒定和診斷方法。

2）血清學(xué)診斷法。由于黃龍病菌目前還不能進(jìn)行人工培養(yǎng)，不能獲得病菌純培養(yǎng)，因此要制備高效的黃龍病菌單克隆抗體比較困難。即便已獲得，但因其單克隆抗體專一性過強(qiáng)，難以適應(yīng)不同地域的黃龍病菌變異菌株，可能會發(fā)生漏檢，故其應(yīng)用與推廣也受到很大的限制。

3）核酸探針雜交法。核酸分子雜交的原理是：具一定同源性的2條核酸單鏈間核苷酸鍵有親和力，在一定的條件下，這2條單鏈按堿基互補(bǔ)原則退火形成雙鏈。雜交的雙方是待測核酸及標(biāo)記探針，標(biāo)記物常選用放射性同位素或非放射性物質(zhì)如生物素等。雜交后，通過標(biāo)記探針放射自顯影或尼龍膜顯帶就可達(dá)到檢測的目的。核酸分子雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是：檢測快速專一，靈敏度高達(dá)ng級。但由于分子探針雜交過程復(fù)雜、需要大量DNA等，限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

4）PCR擴(kuò)增法。目前，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)因具有快速簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為國際上最為可靠并廣泛采用的檢測方法。在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展出了靈敏度更高，特異性更強(qiáng)的巢式PCR技術(shù)（nested-PCR）。為克服常規(guī)PCR和nested-PCR不能準(zhǔn)確定量、容易交叉污染和容易產(chǎn)生假陽性問題，又逐步發(fā)展出了實(shí)時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR）技術(shù)。該技術(shù)融合了PCR和DNA探針雜交技術(shù)，是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)時監(jiān)測整個PCR過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)作為核酸定量的手段，以其高靈敏性、高特異性、高精確度、實(shí)時性、污染少等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，在柑橘黃龍病檢測中得到廣泛應(yīng)用。

2.3 指示物鑒定法[1， 3]

指示植物鑒定是將可疑的枝條嫁接到容易感病的指示植物上，接種3～4個月后觀察其發(fā)病情況。雖然指示植物嫁接鑒定相對于田間診斷法更為準(zhǔn)確，但周期太長，不利于快速檢測。

1）木本指示物鑒定。不同地區(qū)使用的指示寄主也不同，如南非用伏令夏橙，印度用萊檬作為黃龍病的指示植物，而在我國多用椪柑作為黃龍病的指示植物，椪柑嫁接后在25～32 ℃條件下，3個月左右葉片出現(xiàn)斑駁黃化。

2）草本指示物鑒定。在防蟲隔離網(wǎng)室內(nèi)播種草本指示植物長春花，待植株生長至4～6片葉時，采用大花菟絲子（Cuscuta reflexa）或草地菟絲子（Cuscuta campestris）接種。長春花和菟絲子接種3個月左右開始表現(xiàn)明顯癥狀，初為下部葉片最先從葉脈處開始黃化，上部葉片仍表現(xiàn)為健康的綠色，之后整個葉片逐漸均勻黃化，并且黃化的葉片由下而上逐漸增多，最后黃化葉片逐漸脫落。

3）木虱傳毒鑒定。從田間懷疑病株上，采木虱50～100頭，接到指示植物上，或采用飼養(yǎng)的4齡、5齡若蟲或成蟲，在病株上吸毒30 min，保持8～12 d，整個生活期保持傳染性，最后觀察指示物的變化。

2.4? ?試劑鑒定法

筆者采用“黃龍病檢測試劑（專利號：201820411023.5）”在柚樹生產(chǎn)中進(jìn)行試驗(yàn)，并對其準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗(yàn)證，認(rèn)為，該試劑可以與田間識別法結(jié)合使用，對柚樹黃龍病的判斷增加了準(zhǔn)確性，同時能達(dá)到快速和低成本目的。

2.4.1 準(zhǔn)確性驗(yàn)證

筆者在“高原特色作物（瑞麗柚子）科技示范莊園”項(xiàng)目中，對3002株琯溪蜜柚進(jìn)行高接換種時（換成瑞麗水晶柚），在瑞麗水晶柚園內(nèi)采了4個水晶柚枝條樣品送華中農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行黃龍病（HLB）、裂皮?。–EVd）、衰退病（CTV）和碎葉?。–TLV）實(shí)驗(yàn)室鑒定（2017年12月5日送樣，2017年12月26日出報(bào)告）。

為了驗(yàn)證“黃龍病檢測試劑”的準(zhǔn)確性，筆者在原采樣的同柚園同樹上采樣，用“黃龍病檢測試劑”進(jìn)行黃龍病的快速檢測，檢測結(jié)果與原華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鑒定結(jié)果匯總于表1。

從表1的對比發(fā)現(xiàn)，檢測結(jié)果一致。但是，在“黃龍病檢測試劑”使用中存在不少問題，CSM20171111-1和YLY20171111-1樣品樹上采下的新梢，檢測結(jié)果均為陰性，而老葉檢測的結(jié)果為陽性，因此，使用“黃龍病檢測試劑”的正確方法是：每一株被檢柚樹，要采下10片以上老葉或有癥狀的葉片分別檢測，只要有一個葉片出現(xiàn)陽性（+），就判定該株柚樹為黃龍病病樹。如果檢測的葉片太少，“黃龍病檢測試劑”檢測的指導(dǎo)意義就不大。

2.4.2 黃龍病檢測試劑應(yīng)用案例

筆者在瑞麗市布衣農(nóng)莊柚園（E 97°44′32″，N 23°57′39″）中，對疑似黃龍病的12棵柚樹采樣檢測，每棵樹采下老葉或有斑駁狀的葉片10片，每棵樹檢測10次，結(jié)果有4棵數(shù)被判定為陽性（+），屬黃龍病病樹，其余8棵疑似黃龍病的柚樹判定為非黃龍病病樹。通過檢查根系，8棵非黃龍病病樹根系已經(jīng)出現(xiàn)根腐，應(yīng)為根腐所致黃化現(xiàn)象。

3 黃龍病防治方法

3.1 “三步法”

迄今為止，柑橘黃龍病菌不能在離體條件下獲得純培養(yǎng)，因此對該病的研究受到制約[1]。在市場上也找不到一種藥劑直接殺死黃龍病的病原菌（Candidatus liberibacter sp），因此，對黃龍病的防治一直是采用我國植物病理學(xué)家林孔湘教授提出“三步法”[2]，即使用無毒繁殖材料，鏟除病原（樹）和防控木虱。該方法至今仍然是黃龍病防控的不二方法，已為世界各國普遍采用。

3.2 嚴(yán)格實(shí)施植物檢疫及建立無病苗圃，培育無病苗木

要防止黃龍病從疫區(qū)傳染到新區(qū)，加強(qiáng)植物檢疫是最重要的手段。瑞麗市政府正在引導(dǎo)和打造弄島柚子莊園，政府介入，嚴(yán)格實(shí)施植物檢疫制度，是確保弄島柚子莊園綠色、可持續(xù)發(fā)展的重要手段。

培育無病苗木是預(yù)防柑橘黃龍病的基礎(chǔ)保障。所以，農(nóng)業(yè)科研院所及苗木培育公司須建立無病苗圃，無病苗圃的選點(diǎn)要遠(yuǎn)離黃龍病疫區(qū)或者與黃龍病疫區(qū)隔離。除嚴(yán)格選擇無病的母株外，繁殖材料還要通過消毒處理。接穗或苗木用49 ℃濕熱空氣處理50 min，或接穗用47～50 ℃熱水間歇熱處理6～12 min，每24 h一次，共處理3次，或者接穗用四霉素與噁霉靈混合液滅菌消毒，浸泡1～2 h，然后用清水沖洗，晾干備用[7]，可有效脫除黃龍病菌。

3.3 堅(jiān)決防除柑橘木虱

柑橘木虱屬半翅目（Hemiptera）木虱科（Psyllidae），主要危害蕓香科植物，柑橘木虱的寄主植物有：柑橘、黃皮、九里香、枸杞和橙等。其中，木虱在柑橘上危害最重，是傳播柑橘黃龍病主要的自然媒介[8]。傳播黃龍病的木虱主要是亞洲柑橘木虱（Diaphorina citri）和非洲柑橘木虱（Trioza erytreae）。近年來在云南省德宏州發(fā)現(xiàn)的柚喀木虱（Cacopsylla citrisuga Yang&Li）也是黃龍病的傳播媒介[9]。3種木虱成蟲的形態(tài)特征見圖1。

防除傳播黃龍病的這3種木虱，是有效防治柚樹黃龍病的重要環(huán)節(jié)。

3.3.1 利用捕食性天敵瓢蟲防治柑橘木虱

據(jù)報(bào)道，在美國佛羅里達(dá)，六斑盤瓢蟲、雙帶盤瓢蟲、血紅斑瓢蟲、楔斑溜瓢蟲、墨西哥瓢蟲、奇氏光緣瓢蟲和異色瓢蟲是柑橘木虱的主要捕食性天敵，在自然條件下，它們對柑橘木虱卵和若蟲的捕食量累計(jì)可達(dá)80%～100%[10]。廣東省昆蟲研究所龐虹研究發(fā)現(xiàn)，六斑月瓢蟲、紅星盤瓢蟲和龜紋瓢蟲不僅可以捕食爬行能力較弱的木虱若蟲，還可以捕食活動能力較強(qiáng)的木虱成蟲，其中紅基盤瓢蟲在個別果園對柑橘木虱若蟲的捕食量可以超過 80%，幾種瓢蟲在自然界中對柑橘木虱起著重要的控制作用[11]。

所以，在柚園科學(xué)適量釋放捕食性天敵瓢蟲，可以降低柑橘木虱的蟲口基數(shù)，有利于柚園防除柑橘木虱，但必須與化學(xué)防治有機(jī)結(jié)合，才能達(dá)到事半功倍的效果。

3.3.2 化學(xué)防治柑橘木虱

化學(xué)防治柑橘木虱目前仍然是柚子生產(chǎn)中的主要手段，其技術(shù)要領(lǐng)是：選擇有效的農(nóng)藥品種，科學(xué)配制農(nóng)藥，減少或延緩木虱對農(nóng)藥抗藥性;選擇好防治時期，避免黃龍病的傳播。

3.3.2.1推薦用下列農(nóng)藥品種防治柑橘木虱

1）脲類殺蟲劑：虱螨脲（Lufenuron）;2）擬除蟲菊酯類殺蟲劑：溴氰菊酯（Deltamethrin）、聯(lián)苯菊酯（Bifenthrin）、甲氰菊酯（Fenpropathrin）、高效氯氟氰菊酯（Lambda-cyhalothrin）等;3）第二代煙堿類殺蟲劑：噻蟲嗪（ Thiamethoxam ）、噻蟲胺（Clothianidin）等;4）大環(huán)內(nèi)酯類殺蟲劑：阿維菌素（Abamectin）、多殺霉素（Spinosad）等;5）噻二嗪類殺蟲劑：噻嗪酮（Buprofezin）等;6）有機(jī)磷類殺蟲劑：毒死蜱（Chlorpyrifos）等;7）吡啶類殺蟲/殺螨劑：吡蟲啉（Imidacloprid）、啶蟲脒（Acetamiprid）等;8）苯甲酰胺類殺蟲劑：氯蟲苯甲酰胺（Chlorantraniliprole）等;9）生物源殺蟲/殺螨劑：甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（Emamectin benzoate）等;10）昆蟲生長調(diào)節(jié)劑：吡丙醚（Pyriproxyfen）。

3.3.2.2化學(xué)防治時期

柑橘木虱一般每年發(fā)生6～12代。成蟲當(dāng)年在柚子葉背越冬，來年3月上中旬在春梢上產(chǎn)卵繁衍，第一代發(fā)生于3月中旬至5月上旬，最后一代發(fā)生于10月上旬至12月上旬。只要有嫩梢抽發(fā)，成蟲即產(chǎn)卵，嫩梢數(shù)量決定世代的多少。伴隨春梢、夏梢和秋梢的抽發(fā)高峰，若蟲出現(xiàn)3個發(fā)生高峰，因此化防時期為這三季梢的抽發(fā)期。

3.4 挖除病樹

國內(nèi)外實(shí)踐證明，及時挖除病株是有效防控黃龍病的關(guān)鍵手段，僅剪除病枝對防治黃龍病是無效的。挖除病樹后，在穴內(nèi)撒施適量的生石灰，在太陽下暴曬10～20 d后，可以重新補(bǔ)苗。

4 小結(jié)與討論

由于黃龍病潛伏期較長，柚樹染病初期不出現(xiàn)癥狀或癥狀不明顯，因此，如何及早發(fā)現(xiàn)病樹就具有挑戰(zhàn)性。實(shí)驗(yàn)室鑒定法目前主要是專家學(xué)者在研究中使用，柚樹種植戶即使是大戶，也很難應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室鑒定法來發(fā)現(xiàn)柚樹黃龍病;指示物鑒定法由于時間太長，在筆者的調(diào)查中沒有發(fā)現(xiàn)種植戶使用，也成為了專家學(xué)者使用的方法。本文推薦田間識別法與“黃龍病檢測試劑”檢測法相結(jié)合使用，在柚子生產(chǎn)中具有現(xiàn)實(shí)意義。

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