頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法結(jié)合化學計量學分析贛州烤煙樣品中的揮發(fā)性化合物

李 卓，張雄峰，孫瑞玲，杏朝剛，張 棋，張啟明，焦紹赫

（1.江西省煙草科學研究所，江西 南昌 330000；2.甘肅省環(huán)境監(jiān)測中心站，甘肅 蘭州 730020；3.浙江大學農(nóng)生環(huán)測試中心，浙江 杭州 310058；4.瀘州市環(huán)境監(jiān)測中心站，四川 瀘州 646000）

【研究意義】烤煙中揮發(fā)性化合物是煙葉產(chǎn)生香氣的根本原因，也是衡量煙葉品質(zhì)的重要依據(jù)［1-2］。常用的揮發(fā)性化合物萃取或進樣方法有固相微萃?。?］、同時蒸餾萃?。?］、超臨界萃取［5］和頂空法［6-8］。其中固相微萃取受萃取頭極性和厚度的干擾較大；蒸餾萃取耗時且樣品平行性較差；超臨界萃取法成本較高且受夾帶劑影響較大。由于靜態(tài)頂空法直接吸取樣品上方氣體進行分析，操作簡單，條件溫和，能杜絕溶劑的污染，所得到的揮發(fā)性成分與人體嗅覺所感覺到的氣味最接近，與感官評價相關(guān)性好，因此采用靜態(tài)頂空技術(shù)收集煙葉揮發(fā)性化合物。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀被廣泛應(yīng)用于復雜組分的分離、鑒定和定量分析，首先根據(jù)樣品中各組分的沸點、極性或吸附性能不同，將混合體系中的化合物分離開，隨后通過分子、離子和不同豐度的碎片離子確定化合物的分子量和結(jié)構(gòu)信息，可以在沒有部分標準品的情況下確定樣品中多個化合物的結(jié)構(gòu)并進行定量分析［9］。

【前人研究進展】化學計量學是一種統(tǒng)計學工具，廣泛用于數(shù)據(jù)處理、方法選擇、信息提取和結(jié)果解釋［10］。目前已有一些研究是通過建立化學計量學模型將煙草中的感官評吸質(zhì)量與化學成分、卷煙材料或氣候特征相關(guān)聯(lián)從而實現(xiàn)對煙草的質(zhì)量控制。陳義強等［11］采用主成分分析和相關(guān)分析的方法，分析了不同移栽期處理下氣溫指標與感官評吸質(zhì)量的關(guān)系，探討影響煙葉品質(zhì)的關(guān)鍵氣溫因子；張亞平等［12］采用偏最小二乘（PLS）回歸法，考察了卷煙紙組分（亞麻配比、包灰劑質(zhì)量分數(shù)、助燃劑質(zhì)量分數(shù)和助燃劑中鉀鈉比）對常規(guī)和細支卷煙煙氣成分釋放量及感官質(zhì)量的影響；楊超等［13］以9個牌號卷煙的煙葉和配方葉組的氮堿比值、糖氮比值、糖堿比值為研究對象，分析了不同配方組成煙葉的化學成分差異及其組合比例對感官評吸質(zhì)量及風格的影響；李廣才等［14］運用廣義可加模型系統(tǒng)研究了湖南烤煙主要化學成分/指標與評吸質(zhì)量間的線性與非線性關(guān)系；周蕓等［15］分產(chǎn)地、年份、部位系統(tǒng)分析了閩西、滇東、川西南3個清香型典型產(chǎn)地煙葉中游離氨基酸含量（質(zhì)量分數(shù)）及構(gòu)成指標與感官質(zhì)量指標的相關(guān)性?！颈狙芯壳腥朦c】煙氣化學成分被認為與煙葉感官評吸質(zhì)量最直接相關(guān)，而揮發(fā)性香氣成分作為部分煙氣組成和煙氣組分的前體物質(zhì)，必然影響著感官評吸質(zhì)量，目前行業(yè)內(nèi)基于揮發(fā)性化合物的煙草質(zhì)量控制研究并不多見?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過靜態(tài)頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定了贛州烤煙樣品中的揮發(fā)性化合物含量，并采用主成分分析、遺傳算法等化學計量學方法挖掘了贛州不同產(chǎn)地煙葉中揮發(fā)性化合物的含量規(guī)律，并用線性判別分析、反傳-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、最小二乘-支持向量機進行了產(chǎn)地預報分類，在煙草研究和生產(chǎn)領(lǐng)域具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

贛州作為重要的煙葉產(chǎn)地，煙葉產(chǎn)量接近江西全省產(chǎn)量50%，我們收集到贛州6個產(chǎn)煙區(qū)縣共62個烤煙樣品，其中石城14個、瑞金12個、安遠9個、會昌13個、興國5個、信豐9個（表1）。檢測儀器：自動頂空進樣-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 7697A-7890B-5977A, 安捷倫, 美國）。

表1 烤煙樣品的產(chǎn)地信息Table 1 Origin information of flue-cured tobacco samples

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備 先用軟毛刷刷去煙葉上的細土和砂粒，抽去主脈，切絲機切絲，放入40℃的烘箱中烘干，直至煙絲可捻碎，馬上研磨煙絲，研磨不應(yīng)超過 2 min，然后過0.425 mm篩得到粒徑均勻的煙粉樣品［16］。

1.2.2 樣品檢測 （1）靜態(tài)頂空條件。稱樣量：0.3 g；樣品平衡溫度：140℃；樣品環(huán)溫度：170℃；傳輸線溫度：175℃； 輔助加熱區(qū)溫度：185℃；樣品平衡時間：45 min；進樣時間：0.5 min；進樣模式：時間恒定、高壓進樣。

（2）氣相色譜條件。色譜柱：HP-FFAP（50 m×0.32 mm×0.5 μm）；進樣量：1.0 μL，不分流進樣；載氣：氦氣；流速：0.8 mL/min；進樣口溫度：240℃；程序升溫：初始溫度70℃，1.2℃/min升高到110℃，然后1.5℃/min升高到140℃、保持2 min，再5℃/min升高到230℃、保持20min。

（3）質(zhì)譜條件。離子源溫度：230℃；四級桿溫度：150℃；電離能：70 eV；傳輸線溫度：240℃；掃描質(zhì)量數(shù)范圍：35～455 aum；溶劑延遲：6 min；采集模式：全掃描（Scan）與選擇離子檢測（SIM）同時采集。

試驗數(shù)據(jù)采用Matlab軟件（7.0 edtion,Mathworks, 美國）進行統(tǒng)計處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性化合物的識別

將總離子流色譜圖解卷積分析，再對照NIST11庫和Willy08質(zhì)譜庫并參考《煙草與煙氣化學成分》［17］進行驗證，得到54個匹配度大于80的化合物（表2）。

表2 匹配出的54種揮發(fā)性化合物Table 2 List of 54 volatile compounds

（續(xù)表2）

2.2 樣品主成分分析

主成分分析（PCA）是一種無監(jiān)督模式識別方法，其基本思想是對原始特征變量進行降維并最大限度保留有用信息，通過對測量數(shù)據(jù)矩陣進行線性組合形成若干個相互正交的新變量（主成分）［18］。將這54種揮發(fā)性化合物的含量作為變量對62個烤煙樣品進行主成分分析，結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)，石城樣品的第一主成分得分最低，可以和其他幾個產(chǎn)區(qū)區(qū)分開，其他5個產(chǎn)區(qū)的樣品互有重疊，尤其是安遠和會昌樣品，在第一和第二主成分上跨度都很大，分布過于分散；整體而言，第一主成分得分瑞金＜安遠、會昌＜興國、信豐，但由于樣品分布重疊嚴重，分類規(guī)律并不明顯。為此，我們采用遺傳算法-偏最小二乘法（GAPLS）對變量進行篩選，選擇出有利于產(chǎn)地分類的部分揮發(fā)性化合物。

圖1 樣品的主成分投影（PC1～PC2）Fig. 1 Principal component projections of samples (PC1～PC2）

2.3 對揮發(fā)性化合物的變量選擇結(jié)果

GA-PLS是一種廣泛應(yīng)用的變量選擇方法，它根據(jù)達爾文生物進化論中“遺傳-變異-適者生存”的思想模擬自然進化過程，對需優(yōu)化的空間進行隨機搜索，直至目標函數(shù)收斂，從而得到最優(yōu)解，由于結(jié)合了PLS，因此具有較好的預測能力［19］。圖2是GA-PLS運行過程中交叉驗證方差（Cross validation variance, CV）隨變量數(shù)的變化圖，插圖為各變量在迭代運算中出現(xiàn)的頻數(shù)圖，經(jīng)過100次循環(huán)運算后，變量選擇完成。當變量數(shù)在9以上時，CV幾乎達到飽和，上升非常緩慢；當變量數(shù)為11時（黑色箭頭標注），CV達到最大(94.8%），隨后開始略有下降。有文獻報道，特征變量的數(shù)目需遵循以下關(guān)系，S/V＞4（S為樣品數(shù)，V為變量數(shù)）［20］，本研究中，特征變量個數(shù)不能超過15，因此我們選擇迭代運行中出現(xiàn)頻數(shù)在23次及以上的11個變量（圖2插圖中虛線以上）作為主成分分析變量。

圖2 GA-PLS變量選擇迭代運算Fig. 2 Iterative operation diagram of GA-PLS variable selection

圖3 烤煙樣品的GC圖Fig. 3 GC chromatogram of flue-cured tobacco samples

圖3是烤煙樣品的完整色譜圖，4個插圖為色譜圖的局部放大圖，11個所選變量對應(yīng)的色譜峰被一一標出（C1～C11），對應(yīng)的化合物結(jié)構(gòu)式如圖4所示，可以看出，這11種化合物色譜峰面積大小不一，在煙葉中的含量差距很大，說明能引起樣品分類效果改變的指標不一定是含量很高的成分，也可以是一些含量很低的組分，這些低含量組分可能在感官評吸中也起到了重要作用。

圖4 11種揮發(fā)性化合物的結(jié)構(gòu)圖Fig. 4 Structures of 11 volatile compounds

3 討論

3.1 無監(jiān)督模式識別分析結(jié)果

圖5 依據(jù)11個所選變量（揮發(fā)性化合物）的所有樣品的主成分投影（PC1～PC2）Fig. 5 Principal component projections of all samples based on 11 selected variables (volatile compounds) (PC1～PC2)

圖5為42個樣品的主成分得分投影（PC1～PC2），相比較篩選變量前，分類效果得到顯著改善，尤其是安遠和會昌原本分布散落的樣品更加集中，PC1貢獻率達到78.8%，樣品幾乎是沿著PC1依次分布，圖中用灰線分隔成4個區(qū)域，PC1得分依次為石城＜瑞金＜安遠＜會昌、興國、信豐，這和變量篩選前的主成分得分趨勢基本相似，4個區(qū)域的樣品在PC1上就可以完全區(qū)分開，會昌、興國、信豐三地樣品的PC1得分較為接近，但是會昌樣品的PC2得分要明顯高于興國、信豐，在PC2上也能較好區(qū)分，興國、信豐樣品分布比較接近，PC2得分相當，PC1得分信豐稍高于興國，換言之，6個區(qū)縣的樣品幾乎都可以在PC1～PC2投影圖上分開，表現(xiàn)較出較高的產(chǎn)地區(qū)分度。

圖6為11個載荷的主成分投影圖，結(jié)合樣品的投影分布，可以看出這幾種揮發(fā)性化合物整體含量依次為石城＞瑞金＞安遠＞會昌、興國、信豐，而這一地域排序正好與感官評吸上認為的贛州煙葉香型風格從醇甜香韻占主導逐漸向焦甜香韻轉(zhuǎn)變的趨勢相吻合，對于研究贛州乃至省內(nèi)外煙葉香型風格的劃分具有指導意義。其中，樣品中2-乙?；量?-乙酰基呋喃、1-羥基-2-丙酮、1-羥基-2-丁酮、3-呋喃甲醇、甲酸糠酯等化合物含量由高到低依次為石城＞瑞金＞安遠＞會昌、興國、信豐，這幾種物質(zhì)可能是引起醇甜香韻的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)的前體組分；興國、信豐兩區(qū)縣的β-大馬酮、3-甲基-2（5H）-呋喃酮、臧紅花醛含量要低于其他區(qū)縣；會昌樣品的甲酸糠酯含量最低，石城、信豐含量最高。

圖6 所選揮發(fā)性化合物的載荷（PC1～PC2）Fig. 6 Loading plot of 18 volatile compounds (PC1～PC2）

3.2 有監(jiān)督模式識別預報結(jié)果

為了驗證產(chǎn)地分類的可靠性，我們隨機選取42個樣品作為校正集（石城9個、瑞金8個、安遠6個、會昌9個、興國4個、信豐6個），剩余20個樣品作為預報集（石城5個、瑞金4個、安遠3個、會昌4個、興國1個、信豐3個），分別采用線性判別分析(LDA）、反傳-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（BP-ANN）、最小二乘-支持向量機（LSSVM）3種有監(jiān)督模式識別方法對樣品進行產(chǎn)地預報。

LDA是一種線性參數(shù)方法［21］，它根據(jù)對象之間的歐氏距離將最近鄰的對象構(gòu)建成類，通過減少特征向量使得類間方差的比率最大化而類內(nèi)方差的比率最小化，尋求不同類別之間的最大分離，從而對未知樣品進行分類。

ANN是一種模擬生物神經(jīng)系統(tǒng)的非線性計算方法［22］，分為輸入層、隱藏層和輸出層，隱藏層和輸出層都有相應(yīng)的激勵函數(shù)，通過反復的數(shù)據(jù)信息刺激調(diào)整權(quán)值（每層神經(jīng)元與下層神經(jīng)元間權(quán)重）；BP是指調(diào)整權(quán)值的方式為采用最速梯度下降法將訓練誤差從輸出層開始逐層反向傳播到每個隱藏層。

SVM是一個具有稀疏性和穩(wěn)健性的分類方法［23］，通過二次規(guī)劃獲得支持向量（SVs），并將輸入數(shù)據(jù)傳送到高維特征空間。LS-SVM是一種改進的支持向量機方法，通過運用最小二乘系統(tǒng)取代二次規(guī)劃獲得支持向量。該方法的核心是選擇適當?shù)暮撕瘮?shù)并優(yōu)化核參數(shù)，核函數(shù)一般選用徑向基函數(shù)，并通過留一交叉驗證法由網(wǎng)格搜索技術(shù)得到高斯中心μ和分布寬度σ。

表3列出了3種模式識別方法的識別率和預報率結(jié)果。LDA模型的識別率和預報率分別為83.3%和73.7%，分類錯誤樣本分別有7個和5個；BP-ANN模型的識別率和預報率分別為97.6%和95.0%，分類錯誤樣本均只有1個，LS-SVM模型的識別率和預報率分別為100%和95.0%，只有1個預報集樣本分類錯誤。由此可見，BP-ANN和LS-SVM兩個模型得到的預報結(jié)果遠優(yōu)于LDA，這可能是因為樣品和變量之間并不完全線性相關(guān)，LDA僅適用于線性模式識別體系，而BPANN和LS-SVM更適用于存在一定非線性的體系，它們對于非線性模型的預報能力更強，由此我們建立了贛州烤煙樣品的產(chǎn)地鑒別模型。

表3 不同模式識別方法的預報結(jié)果Table 3 Classification results of different pattern recognition methods

4 結(jié)論

本研究通過靜態(tài)頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定了贛州6個產(chǎn)煙區(qū)縣（石城、瑞金、安遠、會昌、興國、信豐）62個烤煙樣品中的54種揮發(fā)性化合物含量，利用遺傳算法篩選出其中11種用于主成分分析，可以基本將原本分類效果不理想的6個區(qū)縣樣品區(qū)分開。通過LDA、BP-ANN、LSSVM等3種有監(jiān)督模式識別方法進行產(chǎn)地預報，其中，BP-ANN和LS-SVM的預報結(jié)果較好，整體預報正確率分別達到96.8%和98.4%，據(jù)此建立了贛州烤煙樣品的產(chǎn)地鑒別模型。該模型可以較為準確地判定烤煙樣品的來源，同時可以找到不同產(chǎn)地間揮發(fā)性化合物的含量規(guī)律，一定程度上可以作為贛州不同區(qū)縣產(chǎn)地烤煙香型風格的判定依據(jù)；該方法也可以推廣用于省內(nèi)其他煙區(qū)乃至全國煙葉的香型風格劃分和質(zhì)量控制，在煙草研究和生產(chǎn)領(lǐng)域具有重要的意義。