環孢素A誘導人胃癌MGC80-3細胞凋亡以及對細胞色素C蛋白表達的影響

黃軍祥 ，胡詠梅，石 海，徐雄飛，周春立

胃癌(gastric cancer，GC)是世界范圍內第五大惡性腫瘤，也是全球由癌癥引起病患死亡的三大惡性腫瘤之一[1]，嚴重威脅人類健康。據報道，接受常規化療藥物的轉移性GC患者的總生存率(overall survival rate，OS)在5年內不到10%[2]；而以曲妥珠單抗為代表的生物療法被引入治療GC，結果顯示在人類表皮受體2(HER-2)GC腫瘤患者中無進展生存期且OS方面均無明顯優勢[3]。因此，針對GC尋找較為理想的治療方法具有重要意義。而誘導腫瘤細胞凋亡是目前針對GC治療的較為理想的方法之一，前期研究[4]表明CsA可顯著誘導人胃癌BGC823細胞凋亡，其機制可能與細胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量產生和線粒體膜電位的下降(△Ψm)有關。有研究[5]顯示線粒體在參與細胞凋亡和炎癥過程中發揮積極作用，強調靶向線粒體功能在改善癌癥治療方面有巨大的潛力。該實驗利用流式細胞儀(flow cytometry,FCM)檢測環孢素A(cyclosporin A,CsA)處理后MGC80-3細胞凋亡率，電鏡觀察細胞線粒體結構變化以及細胞內細胞色素C(cytochrome C)蛋白的表達，進一步探討CsA誘導MGC80-3細胞凋亡的相關機制，為臨床針對GC治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人胃癌MGC80-3細胞株購自中國科學院上海細胞庫。細胞生長條件：含10%胎牛血清和12 U/ml慶大霉素的RPMI-1640培養液中、37 ℃、5%CO2恒溫恒濕培養箱內換液傳代培養，實驗采用對數生長期細胞。

1.1.2藥品、試劑和儀器 CsA標準品凍干粉(中國藥品生物制品檢定所，批號130495-200202,純度98.8%)；RPMI-1640培養基、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；一抗(美國Santa Cruz Biotechnology公司)；內參GAPDH(上海康城生物制品有限公司)；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物公司)；0.22 μm微孔濾膜(美國Pall公司)；CO2恒溫培養箱(日本Sanyo公司)；超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；流式細胞儀(美國貝克曼公司)；透射電子顯微鏡(日本日立公司)；其他實驗所需試劑(美國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1FCM檢測細胞凋亡率 選對數生長期MGC80-3細胞接種于6孔培養板，設對照組，實驗組采用濃度為5、10、20 μmol/L的CsA作用細胞48 h，經胰酶消化收集細胞，濃度調整至5×106/ml～1×107/ml，冰PBS洗滌2次，離心后加入400 μl緩沖液重懸細胞。在4 ℃條件下，加入5 μl AnnexinV-FITC試劑混勻后，放置于培養箱中避光孵育15 min，再加PI 10 μl避光染色5 min，FCM檢測細胞凋亡率，實驗重復3次。

1.2.2電鏡觀察MGC80-3細胞凋亡形態 方法同上，CsA作用MGC80-3細胞48 h后，胰酶消化收集各組約5×106個細胞，吸管將細胞轉移至離心管中，加入4 ℃預冷PBS輕輕吹打均勻，1 000 r/min、4 ℃離心15～20 min，輕輕吸棄上清液。吸管沿管壁緩慢加入4 ℃預冷的2.5%戊二醛溶液2 ml，4 ℃固定24 h。室溫下丙酮脫水處理，包埋、修塊、制備半薄切片，定位后制備超薄切片，經枸椽酸鉛染色，Hitachi-600型透射電鏡觀察和攝片。

1.2.3Western blot檢測細胞蛋白的表達 設對照組，實驗組CsA濃度分別為5、10、20 μmol/L，按上述濃度分別處理MGC80-3細胞48 h后用細胞裂解液提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒行細胞蛋白定量。每孔吸取20 μl蛋白上樣，預先配置SDS-PAGE電泳分離，并將目的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，分別孵化一抗、二抗，5%的脫脂奶粉孵育，PBS洗膜3次，置膜于暗室中ECL試劑盒顯影，掃描儀采集圖像，Image J軟件系統分析Western blot檢測結果。

2 結果

2.1 CsA誘導MGC80-3細胞凋亡MGC80-3細胞經不同濃度CsA處理后，FCM檢測結果如圖1所示，CsA可濃度依耐性誘導MGC80-3細胞發生凋亡，10 μmol/L CsA組凋亡率為(16.57±2.53)%，20 μmol/L CsA組凋亡率為(24.33±1.31)%，與對照組相比，差異均有統計學意義(F=18.64，P<0.05，P<0.01)。

2.2 MGC80-3細胞凋亡形態學的改變結果如圖2所示，電鏡觀察顯示，CsA作用人胃癌MGC80-3細胞后，細胞發生典型凋亡特征變化，如核染色質固縮、核碎裂成碎片等；線粒體也出現損傷，線粒體膜的破裂、腫脹、空泡樣變性等現象(圖2C、2D中箭頭所示)。而對照組細胞線粒體形態正常，嵴清晰完整(圖2A中箭頭所示)。

圖1 CsA對MGC80-3細胞凋亡影響

A：對照組；B：5 μmol/L濃度組；C：10 μmol/L濃度組；D：20 μmol/L濃度組；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖2 電鏡觀察MGC80-3細胞發生凋亡特征性改變

A：對照組；B：5 μmol/L濃度組；C：10 μmol/L濃度組；D：20 μmol/L濃度組

2.3 CsA影響MGC80-3細胞內Cytochrome C蛋白的表達在CsA處理MGC80-3細胞48 h后，細胞內Cytochrome C蛋白表達量隨著藥物作用濃度的增加而明顯增加。實驗結果如圖3所示，CsA濃度為10、20 μmol/L組細胞內蛋白表達水平與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。

3 討論

我國是GC的高發地區，研究[6]顯示在河北省GC發病率和死亡率分別居各類癌癥第二位和第三位，成為當地的主要疾病負擔。因此，針對GC尋找理想的治療手段成為當務之急。CsA作為一種強效免疫制劑，是具有廣泛前景的抗腫瘤藥物，其有抗腫瘤細胞譜廣、毒性低的特點，聯合多種化療藥物能顯著誘導如神經膠質瘤、慢性髓性白血病等腫瘤細胞凋亡，并有協同增加化療藥物的抗腫瘤作用[7-8]。已越來越引起人們的關注。

圖3 CsA作用MGC80-3細胞Cytochrome C蛋白表達

A：對照組；B：5 μmol/L濃度組；C：10 μmol/L濃度組；D：20 μmol/L濃度組；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

本研究結果顯示CsA作用48 h后能濃度依賴性誘導MGC80-3細胞凋亡，電鏡也觀察到細胞發生典型凋亡形態學改變，細胞線粒體膜出現破裂、腫脹，嵴變短或消失；線粒體出現空泡樣變性，可能存在功能失活，表明其誘導凋亡的機制可能與線粒體受損有關。由于線粒體膜受損可改變線粒體通透性，會使△Ψm下降，致線粒體基質腫脹，釋放促凋亡因子，如Cytochrome C，形成被稱為凋亡體的多聚體復合物，并啟動Caspase家族蛋白激活級聯反應，最終細胞發生凋亡[9]。研究[10]表明：通過激活caspase-3、caspase-9和Cytochrome C蛋白表達可誘導人胃癌BGC-823細胞的凋亡。

本實驗前期研究[11]顯示CsA誘導MGC80-3細胞凋亡與激活caspase-3蛋白表達有關。而Cytochrome C作為細胞線粒體凋亡路徑重要信號蛋白，是否也參與了CsA誘導MGC80-3細胞凋亡過程，本實驗利用Western blot法檢出了細胞內Cytochrome C蛋白表達變化，結果顯示CsA可促進細胞Cytochrome C蛋白表達；結合FCM結果，筆者推測CsA誘導MGC80-3細胞凋亡可能與上調Cytochrome C蛋白表達有關聯。關于CsA是否通過線粒體凋亡信號通路誘導MGC80-3細胞凋亡具體機制還有待于后續的研究進一步證實。

由于為線粒體細胞凋亡途徑在癌癥、糖尿病、肥胖、缺血/再灌注損傷等各種病理狀況中扮演著重要角色[9]，所以本實驗通過研究CsA靶位GC細胞線粒體功能，探討CsA誘導MGC80-3細胞凋亡的相關機制，這對于今后開發CsA作為免疫抑制劑在治療胃惡性腫瘤中的重要作用提供科學而有價值的信息。