溫腎養血方對高齡雌鼠卵泡發育的作用及其對PI3K-AKT-FOXO3a通路影響的研究

辛明蔚 張 瑩* 何軍琴 楊 維 武 穎 尹曉丹 賈朝霞

(1．首都醫科大學附屬北京婦產醫院中醫科，北京 100026;2．首都醫科大學附屬北京婦產醫院群體保健科，北京 100026)

卵巢功能是決定女性生育能力的重要因素，但是隨著社會進步、工作緊張、壓力加大，卵巢儲備功能下降的發病率逐年增高且越來越年輕化。卵巢儲備功能下降主要表現為卵巢皮質內原始卵泡數量過早耗竭，不能產生足夠多的卵母細胞或者卵母細胞質量進行性下降，導致激素分泌異常及生育力下降，且流產率和胚胎非整倍體率增加[1-2]。因此揭示卵巢功能減退的機制，建立有效的治療方案，已成為日益增加的臨床需求。近年來，研究[3-4]顯示中醫藥在促進卵泡發育、提高妊娠率及降低西藥的不良反應等方面具有優勢，但其作用機制亟待闡明。本研究借助現代醫學有關本病發病機制的認識及檢測手段，觀察溫腎養血方促卵泡發育的作用機制，探索中西醫結合治療高齡女性不孕癥的科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

中藥飲片購自北京同仁堂股份有限公司。溫腎養血方為首都醫科大學附屬北京婦產醫院趙松泉主任醫師研制的經驗方，其組成為柴胡、香附、木香、赤芍、澤蘭、益母草、牛膝、雞血藤、紅花、丹參、當歸、川芎、蒲黃、熟地、淫羊藿、山茱萸、菟絲子、枸杞子、覆盆子、鹿角、羌活、細辛、肉蓯蓉等。中藥在首都醫科大學中醫藥學院中藥制劑實驗室制備，水煎后濃縮成藥液，4 ℃冰箱儲存備用。孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)，購自以色列Prospec公司，貨號：HOR-272；人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)，購自以色列Prospec 公司，貨號：P139079。

1.2 試驗動物及分組方法

(1)實驗動物：8月齡ICR小鼠體質量40 g，購于北京斯貝福實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0002。采用隨機數字表法將小鼠隨機分為A組：空白組0.9%(質量分數)氯化鈉注射液；B組：控制性超排卵組(controlled ovarian hyperstimulation,COH)組；C組：溫腎養血方低劑量組(16.75 g/kg)；D組：溫腎養血方中劑量組(33.5 g/kg)；E組：溫腎養血方高劑量組(67 g/kg)，灌胃藥物劑量為0.2 mL，每組16只。

1.3 給藥方法及取材方法

連續每日定時(下午6時)灌胃給藥10日，第11天對B、C、D、E組雌鼠同時腹腔注射PMSG 10 IU/只，A、B組雌鼠同時注射等量0.9%(質量分數)氯化鈉注射液，48 h后，腹腔注射HCG 10 IU/只，14 h后,剖腹取出小鼠卵巢及輸卵管，以無菌TB針輕輕劃破輸卵管壺腹部收集卵丘復合物，立即以80 IU/mL的透明質酸酶處理卵丘復合物，剔除卵母細胞周圍的卵丘細胞，用吸卵管反復吹打后，對去除顆粒細胞的卵母細胞在顯微鏡下記數，進行形態學觀察，并計算每只小鼠超排卵數和優質卵泡數。

1.4 生育質量觀察指標

在給藥前及給藥期間每天記錄每只小鼠的體質量，進行統計學分析。記錄小鼠的卵母細胞數量和優質卵泡數量。優質卵泡判定標準：卵母細胞形狀周正，邊緣清晰、平滑，細胞內部均勻透亮。每組記錄4只雌鼠與雄鼠交配后的產仔數量。

1.5 qRT-PCR法檢測小鼠卵巢PI3K、AKT、FOXO3a mRNA的表達

將卵巢組織置于0.9% (質量分數)氯化鈉注射液的DEPC水中，采用電動組織研磨器低溫研磨，采用動物組織總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司，DP431)提取RNA，采用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(北京天根生化科技有限公司，KR106)進行反轉錄，然后采用SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)試劑盒(北京天根生化科技有限公司，FP205)進行qRT-PCR反應：在20 μL體系中加入 12.5 μL PCR Mix上、下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL，置于熒光定量PCR儀中(ABI7300)，95 ℃ 5 min 預變性，95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，在72 ℃采集熒光信號，共40個循環，最后72 ℃延伸5 min。采用2-ΔΔCT法計算PI3K、AKT和FOXO3a mRNA的相對表達量。引物序列：PI3K：上游：5′-CCACGACCATCTTCGGGTG-3′；下游：5′-GGGGAGTAAACATTCCACTAGGA-3′；AKT：上游：5′-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3′；下游：5′-TTGTAGCCAATAAAGGTGCCAT-3′；FOXO3a：上游：5′-ATGGCAGAGGCACCAGCC-3′，下游：5′-CAAAGCTGGGTACCAGGCTGA-3′ (由蘇州鴻訊生物科技有限公司合成)。

1.6 Western blotting法檢測小鼠卵巢PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、FOXO3a、P-FOXO3a蛋白表達

取-80 ℃保存的卵巢組織，經冰冷的PBS 充分洗滌后置入玻璃勻漿器中，然后加入預冷的蛋白裂解液研磨成勻漿，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清液，-80 ℃保存。采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，每個泳道上樣 100 μg。濃縮膠80 V電泳20 min，分離膠120 V電泳2 h；然后100 V恒壓轉膜 1.5 h至PVDF膜。5%(質量分數)脫脂奶粉/TBST室溫封閉1 h。4 ℃孵育一抗過夜，二抗(1∶5 000 稀釋)37 ℃ 1 h。TBST 洗膜3次，每次10 min，發光液曝光30 s～5 min，凝膠成像系統對條帶進行采集和分析。

1.7 免疫組織化學法檢測卵巢組織中PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、FOXO3a、P-FOXO3a蛋白表達

取卵巢組織，浸泡于10%(體積分數)甲醛固定，再先后進行脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟制備組織蠟塊；然后經切片、脫蠟、水化、熱修復，3%(體積分數)H2O2溶液阻斷，加抗體(PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、FOXO3a、P-FOXO3a抗體濃度均為 1∶200)，加生物素化山羊抗小鼠 IgG(兔)，DAB 顯色，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化、返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。高倍鏡下(400×)隨機選取5個視野，Image J軟件測量陽性區域平均吸光度值，取5個視野的平均值作為所測指標的蛋白表達量。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 溫腎養血方對小鼠體質量的影響

各組小鼠體質量變化見表1。給藥過程中，溫腎養血方對各組小鼠體質量沒有明顯影響，差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.2 排卵數及生育結果

B組、C組、D組和E組的排卵數和優質卵泡數均明顯高于A組，差異有統計學意義(P<0.01)；C組和D組的排卵數和優質卵泡數均明顯高于E組，差異有統計學意義(P<0.01)；不同給藥組小鼠的生育個數趨勢與排卵數和優質卵泡數變化的趨勢相一致，C組和D組的生育數均高于E組，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表2。

表1 各組小鼠體質量的變化Tab.1 Body weight changes in different groups of mice

A:blank group;B:controlled ovarian hyperstimulation group;C:low dose group;D:mid dose group;E:high dose group;n=16 for each group.

表2 不同給藥組小鼠排卵及生育結果Tab.2 Number of follicle and high quality follicle in different administration groups of mice

*P<0.01vsgroup A;#P<0.01vsgroup E.A:blank group;B: controlled ovarian hyperstimulation group;C:low dose group;D:mid dose group;E:high dose group;n=16 for each group.

2.3 溫腎養血方對ICR小鼠卵巢PI3K、AKT、FOXO3a mRNA水平的影響

由圖1可知，與A組比較，D組PI3K mRNA的表達下降，在C、E組的表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)；B組、C組AKT mRNA的表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)；B、C、D、E組的FOXO3a mRNA表達均升高，差異有統計學意義(P<0.05)，隨著中藥濃度升高，FOXO3a mRNA表達的含量逐漸下降。

2.4 溫腎養血方對ICR小鼠卵巢PI3K-AKT-FOXO3a通路蛋白水平的影響

與A組相比，D組的P-PI3K、PI3K表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)，E組和A組相比差異無統計學意義(P>0.05)；B組和C組P-AKT、AKT表達水平升高，隨著溫腎養血方給藥濃度的上升，逐漸下降接近空白組水平；P-FOXO3a、FOXO3a在B組、C組、D組表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)，并有隨著給藥濃度的增加逐漸降低的趨勢，詳見圖2。

2.5 免疫組織化學檢測溫腎養血方對ICR小鼠卵巢PI3K-AKT-FOXO3a通路的影響

小鼠卵巢中磷酸化和非磷酸化的PI3K和FOXO3a的蛋白表達水平變化趨勢與qRT-PCR法和Western blotting法檢測結果基本一致。與A組相比，D組的P-PI3K、PI3K表達量均明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)；C組和E組與A組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。與A組相比，B組P-AKT的表達量明顯上升，差異有統計學意義(P<0.01)；D組P-AKT的表達量明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)；C組和E組與A組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。與A組相比，B組和E組AKT的表達量明顯上升，差異有統計學意義(P<0.01)；C組和D組與A組相比差異無統計學意義(P>0.05)。與A組相比，B組、C組和D組P-FOXO3a、FOXO3a的表達量均明顯上升，差異均有統計學意義(P<0.05)；E組與A組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表3，圖3～8。

圖1 溫腎養血方對小鼠卵巢PI3K、AKT、FOXO3a mRNA水平的影響Fig.1 Effects of Wenshen Yangxue Decoction on PI3K,AKT,FOXO3a mRNA level in mouse ovaries

*P<0.01vsgroup A;A:blank group;B: controlled ovarian hyperstimulation group;C:low dose group;D:middle dose group;E:high dose group.

表3 溫腎養血方對小鼠免疫組織化學結果的影響Tab.3 Effects of Wenshen Yangxue Decoction on immunohistochemical results of mice

*P<0.05,**P<0.01vsgroup A.A:blank group;B: controlled ovarian hyperstimulation group;C:low dose group;D:middle dose group;E:high dose group;n=16 for each group.

圖2 溫腎養血方對小鼠卵巢PI3K-AKT-FOXO3a通路蛋白水平的影響Fig.2 Effects of Wenshen Yangxue Decoction on the protein levels of PI3K-AKT-FOXO3a pathway in mouse ovaries

*P<0.05vsgroup A;A:blank；B: controlled ovarian hyperstimulation；C:low dose；D:mid dose；E:high dose.

圖3 ICR小鼠卵巢P-PI3K免疫組織化學染色結果Fig.3 Results of ICR mouse ovarian P-PI3K immunohistochemistry(200×)

A:blank group;B: controlled ovarian hyperstimulation group;C:low dose group;D:mid dose group;E:high dose group.

圖4 ICR小鼠卵巢PI3K免疫組織化學染色結果Fig.4 Results of ICR mouse ovarian PI3K immunohistochemistry(200×)

圖5 ICR小鼠卵巢P-AKT免疫組織化學染色結果Fig.5 Results of ICR mouse ovarian P-AKT immunohistochemistry(200×)

圖6 ICR小鼠卵巢AKT免疫組織化學染色結果Fig.6 Results of ICR mouse ovarian AKT immunohistochemistry(200×)

3 討論

中醫學認為高齡卵巢儲備功能下降的主要原因在于腎。腎藏精，主生殖，“兩精相博，合而成形”，胚胎的形成依賴于男女雙方的先天生殖之精。卵母細胞是能否成功受孕的一個決定性的因素。女子又以肝為先天，肝藏血，肝腎同源，精血互生。張俊博等[5]基于聚類分析對高齡女性不孕癥的中醫證候規律進行了探討，結果顯示，高齡女性不孕癥基本病機以腎虛、血瘀為主。女性進入“五七”之后，生殖能力逐漸下降，腎精漸衰。腎精不足而則肝血不充，肝腎精血虧虛日久而致氣虛，氣虛無力推動血液的運行，而致血瘀，血瘀日久而新血不生，不足以濡養卵泡。本研究中溫腎養血方以溫腎填精、活血養血為治法，熟地、肉蓯蓉、鹿角、淫羊藿等為滋補要藥，滋腎陰補腎陽，陰陽并補；菟絲子、枸杞子、覆盆子、山茱萸等肝腎同補，配伍柴胡、香附、紅花、丹參、川芎、當歸、赤芍、益母草、澤蘭、雞血藤蒲黃等疏肝行氣、活血養血之品，全方陰陽氣血并補，兼行氣活血，使本固血充，氣暢血行，促進卵泡的發育，從而改善卵巢功能。

圖7 ICR小鼠卵巢P-FOXO3a免疫組織化學染色結果Fig.7 Results of ICR mouse ovarian P-FOXO3a immunohistochemistry(200×)

圖8 ICR小鼠卵巢FOXO3a免疫組織化學染色結果Fig.8 Results of ICR mouse ovarian FOXO3a immunohistochemistry(200×)

PI3K-AKT 信號通路與細胞增生、分化密切相關，在卵母細胞和顆粒細胞中均存在完整的 PI3K-AKT 信號系統，它們共同調節著卵泡的生長發育、成熟和排卵，能預測卵母細胞質量[6]。在卵母細胞中，PI3K-AKT 信號通路對于卵泡的激活具有階段特異性，對始基卵泡的發育起決定性作用[7]，可調控始基卵泡的發育和生長、顆粒細胞的增生和分化等過程[8]。PI3K可引起AKT蛋白磷酸化，活化后的AKT可通過調控線粒體蛋白釋放和細胞周期等途徑促進細胞增生、分化和抗凋亡。因此，PI3K信號通路的活性以下游的P-AKT 表達水平為代表。AKT的功能與PI3K相似，可刺激細胞生長。本研究結果顯示COH組和低劑量組P-AKT的蛋白表達水平高于其他組，之后隨著溫腎養血方給藥濃度的上升，P-AKT蛋白表達水平恢復至接近空白組水平；AKT mRNA的表達水平在中藥低劑量組最高，溫腎養血方能調控高齡小鼠PI3K、P-PI3K和AKT、P-AKT的含量。

FOXO家族成員是PI3K-AKT通路的主要效應蛋白，PI3K-AKT通過作用于FOXO蛋白上的磷酸化位點來控制其活性，影響FOXO下游一系列與細胞增生、凋亡及周期阻滯相關基因的表達[9]。Schneider等[10]發現FOXO3a基因可能是抑制原始卵泡過度活化的重要調控因子，可以避免鼠原始卵泡過度耗竭、延長卵巢儲備和生育能力[11-12]，其持續表達會導致卵母細胞及卵泡發育遲緩，從而顯著減少卵母細胞體積[13]，而降低FOXO3a基因表達卻能增加鼠靜息卵巢儲備[14-15]。當某些分子作用卵泡后，PI3K通路激活，使FOXO3a磷酸化，磷酸化的FOXO3a進入胞質，失去活性，卵泡開始發育。本研究結果顯示在COH組中P-FOXO3a和FOXO3a的表達量最高，顯著高于空白組，隨著中藥組給藥濃度增加，P-FOXO3a和FOXO3a的表達量逐漸降低，FOXO3a在高劑量組則降至接近與空白組的水平，表明溫腎養血方可以通過調節FOXO3a的表達量提高卵巢儲備功能、促進卵泡發育。

綜上所述，以上結果初步證明了溫腎養血方能夠促進高齡雌鼠卵泡發育，增加排卵數、優質卵泡數及生育數量，其作用機制可能與調節PI3K、AKT和FOXO3a的表達有關。溫腎養血方低劑量和中劑量效果最好，高劑量次之，可能與中藥濃度增加同時調控了其他相關因子的表達有關，其具體機制仍需進一步探討。