感染依賴性抗原Tp0470的鑒定及在梅毒診斷中的應用

2#張 威段君霞譚宗標夏嘉祥胡楚暉戴桂明趙飛駿

(1.南華大學病原生物研究所/特殊病原體防控湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421001；2.邵陽學院臨床檢驗系，湖南 邵陽 422000；3.南華大學衡陽醫(yī)學院臨床醫(yī)學系在讀本科生，湖南 衡陽 421001)

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum，Tp)感染引起的一種慢性持續(xù)性多階段發(fā)展的疾病，臨床表現(xiàn)復雜，且易與其它疾病相混淆，嚴重危害人類健康[1]。目前國內梅毒實驗室診斷主要依賴RPR/TRUST、ELISA、膠體金等方法初篩，TPPA等方法確診的血清學檢測技術[2]。

RPR/TRUST成本低，但生物學假陽性較高；膠體金技術檢測簡單快速，但靈敏度不高；TPPA是目前國內常用的梅毒確診方法之一，但試劑成本高，操作繁雜不可自動化且不能用于梅毒療效和再感染的判定。近年來，以Tp膜脂蛋白[3-4]及鞭毛蛋白[5]為基礎的ELISA和化學發(fā)光法具有操作簡便、快捷、自動化、數(shù)字化運行等優(yōu)勢，在梅毒篩查中被廣泛應用，但這些抗原仍然無法實現(xiàn)對療效的評判。而基于心磷脂抗原的RPR/TRUST所檢測的反應素滴度變化一定程度上能反映病原體對機體損傷程度[6]，可用于梅毒療效評判，但血清固定現(xiàn)象亦很多見。鑒于以上傳統(tǒng)梅毒血清學方法的不足，仍有必要尋找新型的診斷抗原，以進一步提高對梅毒早期診斷及臨床愈后判斷的價值。

Tp在早期感染機體階段可合成分泌一些蛋白到菌體內外，稱其為Tp感染依賴性抗原(體內誘生抗原)[7-8]，這些蛋白可能在感染早期誘導產生相應抗體，在Tp早期感染中具有潛在診斷價值。本研究在鑒定Tp0470蛋白感染依賴性抗原特性的基礎上，建立基于Tp0470的間接ELISA法，檢測468份各類臨床血清樣本，評價Tp0470在梅毒血清學診斷中的應用價值，為尋求新的梅毒診斷抗原提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質粒和菌株

重組質粒pET32a(+)/Tp0470、pET43.1a(+)/Tp92及E.coliRostta(DE3)株由南華大學衡陽醫(yī)學院病原生物研究所成功構建并保存。Tp Nichols標準株由廈門大學醫(yī)學院附屬中山醫(yī)院臨床檢測中心楊天賜主任惠贈。

1.2 實驗用動物

新西蘭兔(許可證號SCXK湘2015-0004)由南華大學醫(yī)學科學研究中心實驗動物部供應并協(xié)助管理。

1.3 主要實驗試劑

Qiagen基因組提取試劑盒由德國Qiagen公司出品，Toxin EraserTM內毒素去除試劑盒由美國GenScript公司生產，二喹啉甲酸(BCA)微量蛋白純化試劑盒購自中國上海碧云天生物技術有限公司，96孔 ELISA板購自美國Costar公司，辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗人/兔IgG二抗由美國Invitrogen公司生產，TPPA試劑盒產自日本富士瑞必歐株式會社，LZ-ELISA試劑盒(檢測IgG抗體)產自中國珠海麗珠試劑股份有限公司，RPR試劑盒由中國上海科華生物工程股份有限公司出品。

1.4 血清標本來源

468例臨床血清樣本：梅毒陽性(一期60，二期40，三期60，隱性40，胎傳14)共計214例；梅毒陰性(體檢者40，孕婦46，EB病毒感染20，風濕病20，傷寒20，巨細胞病毒感染12，乙肝26，丙肝10，鉤體病30，萊姆病30)共計254例。其中413份血清樣本來自于南華大學附屬常德市第一人民醫(yī)院、衡陽市南華大學附屬第一、第二醫(yī)院2017年3月至2018年3月的部分住院患者；另萊姆病患者血清30份來自中國疾病控制中心，鉤體病血清25份由湖南省疾病預防控制中心惠贈。以上各期梅毒及其它疾病診斷均按照行業(yè)標準進行。

1.5 重組蛋白Tp0470的克隆表達、純化及鑒定

將重組質粒pET32 a(+)-Tp0470轉化至表達菌E.coliRostta(DE3)，雙酶切及測序鑒定，挑取陽性克隆擴增，IPTG(終濃度0.3 mmol/L)誘導表達目的蛋白，SDS-PAGE電泳分析。去內毒素，純化蛋白，Western blot鑒定，測定蛋白濃度，分裝后-80 ℃凍存，用于后續(xù)Tp0470-ELISA的建立和血清樣本檢測。

1.6 Tp0470蛋白的新西蘭兔實驗模型及ELISA建立

3 kg左右新西蘭兔18只，隨機分為三組：實驗一組兔將背部剃毛處理后進行活Tp皮下接種，每只兔背部接種8個皮丘(105IFU/每個位點)，感染期間喂飼無抗生素飼料和飲水。實驗二組用佐劑聯(lián)合高劑量滅活Tp(106IFU/每個位點)同法接種實驗兔，共接種3次(0天，14天，28天)，實驗三組作為未處理對照組。結合兔背部皮丘部位出現(xiàn)紅腫及血清學檢測結果(TPPA及RPR檢測陽性)判定活Tp接種成功。在接種后的8周內，三組實驗兔每只每隔一周均耳緣靜脈抽血1mL分離血清備用。

將純化的Tp0470蛋白(2 mg/L)包被到ELISA反應板，同時設非感染依賴性抗原外膜蛋白Tp92(3 mg/L)為對照，加入5%脫脂牛奶，4 ℃孵育過夜，用PBS-T洗板3次，每孔分別加入100 μL各組兔血清(1∶100稀釋)，37 ℃孵育2 h。PBS-T洗板5次，加入HRP標記山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000稀釋)，37 ℃反應30 min。TMB顯色，20 min后加入終止液。酶標儀讀取A450值，每個血清樣本復測3次。

1.7 臨床樣本的血清學診斷評價

按上述建立的Tp0470-ELISA方法檢測468份血清樣本(包括梅毒陽性血清、正常人血清、交叉血清)，同時對468份血清分別按照商用檢測試劑盒操作說明進行TPPA、珠海麗珠集團的ELISA梅毒初篩和RPR檢測。所有血清樣本需復孔檢測3次。

1.8 梅毒治療前后血清樣本的RPR滴度與Tp0470-ELISA A450值相關性分析

選取上述200份各期梅毒患者血清樣品(不包括14例胎傳梅毒血清樣本)中的20人份梅毒隨訪患者血清，分析比較Tp0470-ELISA A450值與RPR滴度(分為3個等級：滴度不變，滴度2倍變化，滴度4倍變化)的變化關系。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS軟件(18.0)對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。感染依賴性抗原的篩選采用重復測量的方差分析；臨床評價指標有靈敏度、特異度、符合率、kappa值及ROC曲線。kappa值≤0.4一致性較差，0.4

2 結 果

2.1 重組質粒pET32a(+)-Tp0470的鑒定及在E.coli Rostta(DE3)中的表達

將pET32a(+)-Tp0470重組質粒進行BamHⅠ+XhoⅠ雙酶切分析，目的條帶大小與預期值一致。pET32a(+)-Tp0470誘導表達目的蛋白結果如圖1所示，可見一分子量約57 kDa大小的蛋白條帶。

圖1 重組質粒pET-32a(+)-Tp0470轉化E.coli Rostta(DE3)表達結果BI:誘導前；AI:誘導后；S:上清；FT:穿透；M:Marker；E1,E2,E3,E4,E5,E6：洗脫液

2.2 Tp0470蛋白感染依賴性抗原屬性的鑒定

實驗組在0～8周不同時間點兔血清中特異性Tp0470和Tp92抗體檢測結果如圖2A、B所示。活Tp接種組兔血清中抗Tp0470水平從感染后第3周起呈急劇上升趨勢，至5周后逐漸趨于平穩(wěn)，而滅活Tp接種組及未接種組抗Tp0470水平一直處于低位且未有升高趨勢。與滅活Tp接種組相比，活Tp接種組血清抗Tp0470水平在3～8周各時間點均有顯著差異(F值分別為114.7、448.5、513.6、528.7、979.4和1688.3，P<0.05)。

圖2 不同兔實驗組不同時間點不同蛋白的抗體水平A450值變化A：不同兔實驗組不同時間點Tp0470的抗體水平A450值變化B：不同兔實驗組不同時間點Tp92的抗體水平A450值變化

活Tp接種組與滅活Tp接種組血清抗Tp92水平從接種后第3周起均呈現(xiàn)上升趨勢，5周后逐漸趨于平穩(wěn)。而在3～8周各時間點兩組間差異并無顯著性(F值分別為0.92、1.48、2.76、2.85、2.97和2.88，P>0.05)。

2.3 Tp0470-ELISA與TPPA、LZ-ELISA及RPR的比較評價

Tp0470-ELISA對214份各期梅毒血清樣本的檢測陽性率如表1所示，其中檢測陰性的有10人份，對應患者年齡均大于42歲，且RPR滴度均小于等于1∶4。以TPPA法為金標準，Tp0470-ELISA檢測468份血清的靈敏度、特異度及符合率如表2所示，均較好；ROC曲線下面積達到0.907(圖3)。

Tp0470-ELISA與LZ-ELISA及上海科華RPR試劑盒檢測468份血清結果比較(表2)，其符合率分別為94.87%，Kappa=0.897；88.67%，Kappa=0.771。均大于0.75，顯示Tp0470-ELISA與這兩種方法結果一致性好。

表1 基于Tp0470蛋白的ELISA對臨床各期梅毒的診斷陽性率

圖3 Tp0470的ROC曲線圖(以Tp0470-ELISA檢測S/CO為檢測變量，TPPA為陰陽性判斷金標準，做ROC曲線)

表2 Tp0470-ELISA與TPPA、LZ-ELISA及RPR試劑盒的診斷評價比較

2.4 梅毒患者治療前后血清檢測Tp0470-ELISA A450值與RPR滴度變化分析比較

Tp0470-ELISA做20例隨訪病人檢測，記錄其治療前后的ELISA A450值及RPR的滴度變化，通過計算隨訪病人治療前后A450值差值，分析與RPR滴度變化的情況(分為3個等級：滴度不變，滴度2倍變化，滴度4倍變化；圖4)。經Spearman秩相關分析，Tp0470-ELISA A450值與RPR滴度變化相關系數(shù)為0.38，P=0.96。

圖4 Tp0470-ELISA A450值與隨訪病人RPR滴度下降的變化圖

3 討 論

如何進一步從Tp全菌蛋白中尋找到提高梅毒早期診斷率，或能用于梅毒療效判斷的新靶標蛋白一直是當前梅毒臨床診斷方法優(yōu)化的突破點之一。體內誘生抗原(又稱感染依賴性抗原)篩選技術的興起[7-8]促進了空腸彎曲菌[9]、弓形蟲[10]等病原體的診斷相關應用研究，感染依賴性抗原為這些病原體的診斷提供新靶標，這也為梅毒診斷抗原篩選提供了除外膜蛋白外的新思路。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，梅毒螺旋體感染依賴性抗原Tp0971[11]在早期診斷和療效評價具有潛在價值，結合活Tp接種和滅活Tp接種后兔血清反應性的顯著差異，初步證實Tp0470為一種感染依賴性抗原。

本研究基于Tp0470蛋白建立ELISA并檢測了468份臨床各類血清，檢測結果與傳統(tǒng)的TPPA確診試驗相比顯示其具有較高的靈敏度(95.32%)和特異度(95.66%)。ROC曲線分析進一步提示Tp0470有作為梅毒診斷靶標抗原的潛質。盡管Tp0470蛋白建立的ELISA在對一期梅毒和隱性梅毒血清樣本的檢測中其陽性檢出率分別只有91.66%和92.50%，表面上看該蛋白似乎不太適用于梅毒早期和潛伏期感染的篩選，但由于本次基于Tp0470蛋白建立的ELISA只檢測了IgG型抗體，且樣本來源地區(qū)相對單一及血清樣本數(shù)少等局限性，尚無法做出Tp0470-ELISA不適用梅毒早期診斷的定論。仔細分析Tp0470-ELISA檢測結果為假陰性的10份梅毒陽性血清的基本資料后發(fā)現(xiàn)其對應患者年齡均大于42歲，且樣本RPR檢測結果滴度均小于1∶4，這與前期研究報道的Tp0462蛋白檢測為假陰性梅毒血清樣本(8人份)的特征非常一致。年齡可能是造成這部分患者機體免疫應答損傷進而使這類抗原對應抗體水平低下的原因之一；也可能是這部分患者本身經歷了梅毒感染到治愈的過程，導致了Tp0470蛋白刺激機體產生的IgG抗體水平逐漸下降，直至轉為陰性，但RPR檢測的反應素由于血清抵抗而一直保持在低滴度。

對20份隨訪患者治療前后血清的A450值變化與RPR滴度變化分析后，其相關系數(shù)為0.38，P=0.96，并無顯著統(tǒng)計學意義，這在某種程度上來說基于Tp0470建立的ELISA似乎尚無法替代RPR或TRUST判斷梅毒治療后的效果。由于抗生素的濫用，梅毒患者不一定在同一醫(yī)院就診等原因，使得隨訪患者的血清相對來說難以收集，導致本研究中隨訪患者的標本量偏少，同時由于很多患者并未嚴格按照醫(yī)囑進行規(guī)范化治療和復查等原因造成收集的血清質量參差不齊，因而兩種方法療效判斷是否具有相關性還有待商榷。后續(xù)研究將收集更多梅毒感染治療后隨訪的各期梅毒患者(從就診到治愈期間)血清標本，并采用新西蘭兔模擬感染和治療模型來進一步驗證結果。同時結合前期篩選評價的Tp膜脂蛋白及感染依賴性抗原的優(yōu)勢表位肽段，合成多聚肽，期望合成的Tp多抗原多聚肽能在梅毒臨床診斷和預后判斷上發(fā)揮更優(yōu)的作用。

作為菌體抗原研究的新靶標，感染依賴性抗原的應用并不僅僅局限于診斷，它們特殊的生物學特性：只在活菌感染宿主以后合成分泌，可能與病原體入侵機體和其自身新陳代謝密切相關[10]，研究發(fā)現(xiàn)免疫胸膜炎放線桿菌的感染依賴性抗原后，能有效地抑制該病原體對肺組織的損傷[12-13]。梅毒螺旋體不同于常規(guī)的革蘭氏陰性菌具備典型的毒力因子脂多糖，也無法進行長期的體外單獨培養(yǎng)，但其卻能持續(xù)感染機體并引發(fā)一系列的臨床癥狀。盡管有研究者對梅毒螺旋體進行了培養(yǎng)，卻仍需棉尾兔細胞做載體[14]。多年來，研究者們一直致力于尋找其毒力因子，進而突破疫苗[15]和致病機制研究[16]的困境，但效果并不顯著。感染依賴性抗原或許可以成為疫苗研究的新觸點，同時對感染依賴性抗原進行多菌種多表型的同源性比對，篩選出同源和非同源基因，對梅毒螺旋體感染機體和自身代謝合成的機制研究都有一定價值。