MAD1基因在主動脈夾層中的表達及對主動脈平滑肌細胞的影響

(1.中國醫學科學院阜外醫院胸心外科，北京 100037；2.中國醫學科學院阜外醫院 北京協和醫學院 國家心血管病中心 心血管疾病國家重點實驗室 心臟外科，北京100037)

主動脈夾層指主動脈腔內的血液從主動脈內膜撕裂處進入主動脈中膜，形成的真假兩腔分離狀態[1]，是一種起病迅速、死亡率高的大血管疾病[2]；若未得到及時有效治療，死亡率至發病起以每小時2%～5%遞增[3]。雖然近年來臨床對主動脈夾層的診治水平有了明顯提升，但圍手術期患者死亡率仍超過20%[4]。目前對主動脈夾層的發病機制仍未完全明確，闡明發病機制對改良治療方案，提升患者預后水平具有重要意義。研究者發現，主動脈中膜在維持主動脈生理結構和功能中發揮決定作用，血管平滑肌細胞是主動脈中膜最主要的組成成分[5]。亦有研究顯示，主動脈夾層發生、發展中存在明顯的主動脈中膜血管平滑肌細胞丟失，被認為與血管平滑肌細胞增殖、凋亡功能異常有關[6]，但分子機制仍未闡明。有絲分裂阻滯缺陷蛋白(Mitotic arrest deficient protein，MAD)和MAX作用蛋白(Max interacting protein，MAX)，均屬于原癌基因Myc family oncogene(MYC家族)[7]；相關研究顯示，MAX高表達可明顯抑制主動脈平滑肌細胞生長，促進凋亡，參與主動脈夾層的發生、發展[8]。但關于MAD表達與主動脈平滑肌細胞的關系及在主動脈夾層發病中的作用仍未見研究報道。MAD各亞型中以MAD1研究最為廣泛，已有報道證實，MAD1基因在白血病、乳腺癌、鼻咽癌等多種惡性腫瘤中發揮調控作用[9-10]。本研究收集了Stanford A型主動脈夾層患者的升主動脈病變組織中膜標本，檢測MAD1基因表達水平；并通過腺病毒載體轉染技術在體外建立MAD1基因高表達人主動脈血管平滑肌細胞模型，檢測細胞增殖、凋亡情況以及凋亡相關蛋白的表達水平。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2017年3月至2018年6月間在本院行手術治療的主動脈夾層患者30例。入選標準：①經CT、MRI、超聲檢查并結合臨床癥狀確診為Stanford A型主動脈夾層患者；②發病到住院時間≤14天。排除標準：①Stanford B型或慢性主動脈夾層患者；②馬凡氏綜合征、主動脈瓣二葉瓣化畸形的患者。其中男性22例，女性8例；年齡28～68歲，平均年齡(46.30±12.75)歲。收集術中切除的升主動脈病變組織，保留富含血管平滑肌的中膜組織標本為主動脈夾層組。收集同期在本院行尸檢，且無手術史、無大血管病變史的升主動脈壁內組織標本18份為對照組，其中男性10例，女性8例；年齡30～65歲，平均年齡(46.15±6.90)歲。兩組性別、年齡之間差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經本院倫理委員會審核通過，受試者家屬簽署知情同意書。

1.2 材料與主要試劑

人主動脈血管平滑肌細胞(HA-VSMC)購于上海滬震生物科技有限公司；腺病毒載體AdEasy系統由北京安必奇生物科技有限公司設計合成；CCK8試劑盒、Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒購于上海鈺博生物科技有限公司；兔抗人MAD1多克隆抗體，鼠抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(csyteine aspartic acic specific protease，Caspase)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9單克隆抗體均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養與轉染 HA-VSMC細胞放入含10%胎牛血清的DMEM培養基中，37 ℃ 5%CO2的細胞培養箱中培養并傳代，傳至5～6代時取對數生長細胞用于后續實驗。使用腺病毒載體AdEasy系統過表達MAD1，分為空白對照組、空載體轉染組、MAD1過表達組；轉染48h后通過RT-PCR和Western blot驗證各組細胞中MAD1 mRNA和蛋白表達情況。

1.3.2 細胞增殖和凋亡實驗 使用CCK8試劑盒檢測細胞增殖能力，按5 000個/孔的密度將細胞接種于96孔板中，常規培養12 h后分別以重組腺病毒AdEasy-MAD1和空載體轉染細胞，同時設置空白對照組，分別于轉染前，轉染后24 h、48 h、72 h，每孔滴加10 μL CCK8溶液，繼續培養1h后，酶標儀讀取490 nm處吸光度值。細胞凋亡實驗：細胞轉染48 h后，使用Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒進行測定，操作按試劑盒說明進行。

1.3.3 RT-PCR檢測 Trizol法提取主動脈組織和HA-VSMC細胞中的總RNA，反轉錄得到cDNA。引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成，MAD1引物序列：上游5′-CCAACGAGAAGCAGCGAGAG-3′，下游5′-GTGAGGTTCCTCTCTTCCGT-3′；Caspase-3引物序列：上游5′-CAGTTAGGACAGGCACAGGC-3′，下游5′-GCTTGCTCTGAGACCGTACG-3′；Caspase-8引物序列：上游5′-GGACAGCCGAAGACGATA-3′，下游5′-GTAACGACCAGAGTGACC-3′。Caspase-9引物序列：上游5′-CCACTAT CTAACCAGGTTAAC-3′，下游5′-TGTTCAGTAATAATGGGAGTG-3′。反應體系30 μL，反應條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，共40個循環，延伸72 ℃ 1 min。行2%瓊脂糖凝膠電泳，以GAPDH為內參，計算MAD1、Caspase-3、Caspase-8 、Caspase-9 mRNA的相對表達量。

1.3.4 Western blot檢測 對Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 從前提轉變為cleaved Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 的蛋白表達水平進行檢測，RIPA提取主動脈組織和HA-VSMC細胞中總蛋白，BCA法蛋白定量。蛋白樣品行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉膜至PVDF，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，滴加兔抗人MAD1多克隆抗體(1∶200)，鼠抗人Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9單克隆抗體(1∶500)，4 ℃過夜，滴加HRP標記羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(1∶1 000)，室溫反應2 h，ECL顯色，避光顯影，以GAPDH為內參對照計算各條帶灰度值。

1.4 統計學分析

使用SPSS18.0軟件分析，以均數±標準差表示，多組間進行F檢驗，兩組間進行t檢驗，以α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 主動脈夾層中MAD1 mRNA和蛋白表達分析

RT-PCR檢測顯示，主動脈夾層組患者主動脈夾層中MAD1 mRNA相對表達量明顯高于對照組(P<0.05)；Western blot檢測顯示，主動脈夾層組患者主動脈夾層中MAD1蛋白相對表達量明顯高于對照組。見圖1，表1。

圖1 主動脈夾層中MAD1蛋白表達的Western blot電泳圖注：1～2為對照組；3～4為主動脈夾層組

表1 兩組主動脈夾層中MAD1 mRNA和蛋白表達分析

2.2 過表達MAD1的細胞系構建與驗證

轉染48 h后，空白對照組、空載體轉染組、MAD1過表達組MAD1mRNA相對表達量分別為1.42±0.11、1.50±0.18、8.05±0.73；MAD1蛋白相對表達量分別為1.07±0.09、1.12±0.14、7.63±0.59。MAD1過表達組MAD1mRNA和蛋白相對表達量均明顯高于空白對照組、空載體轉染組，差異有統計學意義(P<0.05)；證明已成功構建過表達MAD1的HA-VSMC。

圖2 各組MAD1蛋白的Western blot電泳圖1：空白對照組；2：空載體轉染組；3：MAD1過表達組

2.3 各組細胞增殖情況

轉染前各組細胞增殖情況之間差異無統計學意義(P>0.05)；隨著轉染時間的延長，各組細胞增殖水平均逐漸增加，轉染48 h、72 h后MAD1過表達組細胞增殖明顯低于空白對照組、空載體轉染組(P<0.01)；空白對照組與空載體轉染組細胞增殖之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組細胞增殖情況分析(OD值)

組別轉染前轉染24 h轉染48 h轉染72 h空白對照組0.17±0.060.45±0.080.97±0.191.40±0.26空載體轉染組0.18±0.060.43±0.110.99±0.251.37±0.24MAD1過表達組0.18±0.090.39±0.150.51±0.17ab0.64±0.19ab

與空白對照組比較，aP<0.05；與空載體轉染組比較，bP<0.05

2.4 各組細胞凋亡情況分析

轉染48 h后，空白對照組、空載體轉染組、MAD1過表達組細胞凋亡率分別為：(5.31±0.86)%、(5.40±0.93)%、(17.65±2.50)%。MAD1過表達組細胞凋亡率明顯高于空白對照組、空載體轉染組，差異有統計學意義(P<0.01)；空白對照組與空載體轉染組細胞凋亡率之間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 Annexin V細胞凋亡檢測(400×)

2.5 各組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA表達水平比較

MAD1過表達組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA相對表達量明顯高于空白對照組、空載體轉染組，差異有統計學意義(P<0.05)；空白對照組與空載體轉染組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA相對表達量差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA相對表達量比較

與空白對照組比較，aP<0.05；與空載體轉染組比較，bP<0.05

2.6 各組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表達水平比較

MAD1過表達組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白相對表達量明顯高于空白對照組、空載體轉染組(P<0.05)；空白對照組與空載體轉染組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白相對表達量差異無統計學意義(P>0.05)。見表4、圖4。

圖4 各組細胞凋亡相關蛋白的Western blot電泳圖1：空白對照組；2：空載體轉染組；3：MAD1過表達組

表4 各組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白相對表達量比較

與空白對照組比較，aP<0.05；與空載體轉染組比較，bP<0.05

3 討 論

隨著近年來我國人口老齡化和高血壓患者的增加，主動脈夾層的發病率明顯提升，而且已成為嚴重威脅居民生命安全的危重癥之一[11]。主動脈夾層可累及體內多個系統，表現復雜多樣，常表現為高血壓、胸痛、主動脈瓣關閉不全等[12]。主動脈夾層發病機制目前仍未完全明確，研究者認為，主動脈內膜、中膜和外膜結構和功能的改變可能在主動脈夾層發生發展中發揮重要作用，其中主動脈中膜在維持主動脈壁生理結構和功能的首要因素，平滑肌細胞丟失、凋亡、數量下降等導致的主動脈中膜重構是主動脈夾層發生的病理基礎[13]。MAD和MAX可通過與自身或MYC家族其他成員形成同源二聚體或異源二聚體，在細胞生長和凋亡中發揮調控作用[14]。已有研究證實，MAX表達上調可抑制主動脈平滑肌細胞生長，促進細胞凋亡。目前研究發現，MAD1基因在白血病、乳腺癌、鼻咽癌等多種癌癥的發生、發展過程中發揮調控作用；但在主動脈夾層發病過程中的作用仍未見相關研究報道。

Stanford A型主動脈夾層是一種急需手術治療的致命性疾病，是主動脈夾層中致死率最高的類型[15]。本研究以在本院行手術治療的Stanford A型主動脈夾層患者為研究對象，收集術中切除的升主動脈病變組織中膜部分為研究標本。研究結果顯示，Stanford A型主動脈夾層患者升主動脈病變組織中膜部分組織中MAD1 mRNA和蛋白表達水平明顯高于正常升主動脈壁內組織。提示MAD1高表達可能在主動脈夾層發生發展中發揮調控作用。進一步在體外建立MAD1基因過表達人主動脈血管平滑肌細胞模型，檢測細胞增殖和凋亡情況發現，MAD1基因過表達可明顯抑制HA-VSMC細胞增殖，促進細胞凋亡，加重主動脈夾層病情。

Caspase家族是一組存在于細胞質溶膠中的半胱氨酸蛋白酶，目前已確定至少11種亞型，在細胞凋亡信號傳導中發揮重要作用，是細胞凋亡的執行者[16]。研究者發現，Caspase級聯反應是細胞凋亡的主要原因，其中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9作用最明顯[17]；Caspase-3位于級聯反應下游，直接誘導細胞凋亡[18]。細胞凋亡的胞外途徑中，凋亡信號傳導分子與Caspase-8特異性結合，活化后的Caspase-8與Caspase-3相互作用，激活Caspase-3，誘導細胞凋亡[19]；細胞內途徑中，凋亡信號因子與相關蛋白酶形成復合物，之后與細胞質中Caspase-9前體結合，激活Caspase-9，進而活化下游Caspase-3，誘導細胞凋亡[20]。本研究中，MAD1過表達組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表達水平較空白對照組與空載體轉染組明顯增加，提示MAD1過表達促進HA-VSMC細胞凋亡可能通過激活細胞外凋亡途徑和細胞內凋亡途徑來實現的。