COPD患者外周血SIRT1及NF-KB、MMP-9的表達水平分析

(荊門市第一人民醫院1.檢驗科，2.婦科，3.全科醫學，湖北 荊門 448000)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種具有氣流阻塞特征的慢性支氣管炎和肺氣腫，可進一步發展為肺心病和呼吸衰竭的常見慢性疾病，多發于中老年人群[1]。目前已有的治療方案仍無法完全抑制病情發展，在降低患者死亡率方面效果不佳[2]。探索COPD病情發展中的特異性生物標志物和相關信號通路對闡明發病機制，對開發新的治療藥物，改善患者治療預后具有重要意義。近年來研究發現，沉默信息調節因子相關酶1(Silence Information Regulator Related Enzyme 1，SIRT1)在細胞應激反應調控中發揮關鍵作用[3]，且與神經性病變、糖尿病等多種年齡相關疾病的發生、發展密切相關[4]。但SIRT1在COPD病情發展中的研究仍鮮有報道。本文通過分析COPD患者外周血中SIRT1和炎癥因子：核因子κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)、基質金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表達水平，探討SIRT1在COPD病情發生、發展中的可能調控機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年6月至2017年12月間本院收治的COPD急性加重期患者80例，其中男性45例、女性35例，年齡51～79歲，平均年齡(65.30±7.62)歲。另取同期穩定期COPD患者60例，其中男性36例、女性24例，年齡50～76歲，平均年齡(64.15±6.95)歲。納入標準：符合中華醫學會制定的慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013修訂版)中的診斷標準；COPD急性加重期判斷標準：PCO2>50 mmHg，合并PO2<60 mmHg、呼吸頻率>30次/分，呼吸困難、咳嗽等臨床癥狀明顯加重。排除標準：①合并肺炎、哮喘、肺栓塞、肺結核的患者；②合并肝腎功能嚴重障礙，惡性腫瘤，自身免疫性疾病的患者。選取同期在本院體檢的健康中老年人60例為對照組，其中男性34例、女性26例，年齡50～75歲，平均年齡(64.90±6.31)歲。三組性別、年齡方面差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經本院倫理委員會審核批準，患者及健康體檢者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

SIRT1、NF-κB、MMP-9 Elisa試劑盒購于上海聯邁生物工程有限公司；DMEM培養基、胎牛血清購于北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑、BCA試劑盒均購于上海康朗生物科技有限公司；兔抗人SIRT1、NF-κB、MMP-9、β-actin多克隆抗體、兔抗人IgG(HRP標記)購于上海北諾生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肺功能檢測 分別于COPD急性加重期患者治療前、穩定期COPD患者和對照組受試者入院時，使用GERATHERM肺功能測試儀測定用力肺活量(FVC)、第一秒用力呼氣容積(FEV1)及占預估值的百分比(FEV1%)。檢測前24h COPD患者未使用支氣管擴張劑。

1.3.2 樣品采集與血清SIRT1、NF-κB、MMP-9檢測 COPD急性加重期患者治療前、穩定期和對照組受試者入院時采集清晨空腹肘靜脈血5 mL，取其中2 mL室溫下2 000 r/min離心20 min，分離上層血清，Elisa法檢測SIRT1、NF-κB、MMP-9水平，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.3.3 外周血單核細胞分離 取外周血3 mL，2 000 r/min離心10 min，收集血細胞，加入人外周血淋巴細胞分離液，收集單核細胞，磷酸緩沖液洗滌3次，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基中，以1×106/L細胞濃度接種于6孔板中，放入37 ℃ 5%CO2細胞培養箱中培養24 h，收集貼壁的單核細胞。

1.3.4 RT-PCR檢測SIRT1、NF-κB、MMP-9 mRNA表達Trizol法提取外周血單核細胞總RNA，逆轉錄得到cDNA。SIRT1、NF-κB、MMP-9及內參β-actin引物合成由上海斯信生物科技有限公司完成，SIRT1引物序列：上游5′-TTAAGCGTCGAATATCAGAACT-3′，下游5′-GTGGGAAGAGGTC ATCAGGAG-3′；NF-κB引物序列：上游5′-CTCATGG TCAACGCCAAGTG-3′，下游5′-CCTGTAGCGATGCGTCGAG-3′；MMP-9引物序列：上游5′-GTATTGTC GTCTCCGTAAGGC-3′，下游5′-CTGCTCCGTTCTCAAAGTGGAA-3′；內參β-actin引物序列：上游5′-CAAGAGTCGG AACTGCCAC G-3′，下游5′-AGGTGA CCGCAGAAGTGGT-3′。反應條件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，72 ℃ 30 s，共35個循環，延伸72 ℃ 10 min。擴增產物行2%瓊脂糖凝膠電泳，計算SIRT1、NF-κB、MMP-9 mRNA的相對表達量。

1.3.5 Western blot檢測SIRT1、NF-κB、MMP-9蛋白表達 外周血單核細胞中加入RIPA蛋白提取劑，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min后取上清，BCA法蛋白定量，定量后的總蛋白加入適量緩沖液，行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法電轉移將蛋白轉膜到PVDF，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別滴加兔抗人Sirt1多克隆抗體(1:200)、兔抗人NF-κB多克隆抗體(1∶200)、兔抗人MMP-9多克隆抗體(1∶200)、兔抗人β-actin多克隆抗體(1∶500)，4 ℃過夜，滴加HRP標記的兔抗人IgG(1∶1 000)，室溫孵育1 h，ECL顯色，暗室中顯影，分析各條帶灰度值。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 三組肺功能檢測指標比較

COPD穩定期組和急性加重組患者FEV1、FEV1/FVC、FEV1%明顯低于對照組(P<0.05)；COPD急性加重組患者FEV1、FEV1/FVC、FEV1%明顯低于COPD穩定期組(P<0.05)。見表1。

表1 三組肺功能檢測指標比較

注：與對照組相比，aP<0.05；與COPD穩定期組相比，bP<0.05

2.2 三組血清SIRT1、NF-κB、MMP-9水平比較

COPD穩定期組和急性加重組患者血清SIRT1水平明顯低于對照組，COPD急性加重組明顯低于穩定期組，差異有統計學意義(P<0.05)；COPD穩定期組和急性加重組患者血清NF-κB、MMP-9水平明顯高于對照組，COPD急性加重組明顯高于穩定期組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 三組血清SIRT1、NF-κB、MMP-9水平比較 (ng/mL)

注：與對照組相比，aP<0.05；與COPD穩定期組相比，bP<0.05

2.3 三組SIRT1、NF-κB、MMP-9 mRNA表達水平比較

COPD穩定期組和急性加重組患者SIRT1 mRNA相對表達量明顯低于對照組，COPD急性加重組明顯低于穩定期組，差異有統計學意義(P<0.05)；COPD穩定期組和急性加重組患者NF-κB、MMP-9 mRNA相對表達量明顯高于對照組，COPD急性加重組明顯高于穩定期組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 三組SIRT1、NF-κB、MMP-9 mRNA相對表達量比較

注：與對照組相比，aP<0.05；與COPD穩定期組相比，bP<0.05

2.4 三組SIRT1、NF-κB、MMP-9蛋白水平比較

COPD穩定期組和急性加重組患者SIRT1蛋白相對表達量明顯低于對照組，COPD急性加重組明顯低于穩定期組，差異有統計學意義(P<0.05)；COPD穩定期組和急性加重組患者NF-κB、MMP-9蛋白相對表達量明顯高于對照組，COPD急性加重組明顯高于穩定期組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表4。

圖1 Western blot檢測SIRT1、NF-κB、MMP-9蛋白水平1：對照組；2：COPD穩定期組；3：COPD急性加重組

表4 三組血清SIRT1、NF-κB、MMP-9蛋白表達水平比較

與對照組比較，aP<0.05；與COPD穩定期組比較，bP<0.05

2.5 相關性分析

Pearson相關性分析顯示，SIRT1 mRNA和蛋白表達水平與COPD患者FEV1、FEV1/FVC、FEV1%呈明顯正相關(r=0.581、0.643、0.610，P<0.01)；SIRT1 mRNA和蛋白表達水平與NF-κB、MMP-9水平呈明顯負相關(r=-0.442、0.395，P<0.01)。

3 討 論

COPD是小氣道堵塞性病變，因病情發展緩慢，患者主要為中老年人；研究認為COPD可反映肺部加速老化[5]。COPD發生、發展中體內多種炎性介質和細胞因子發揮關鍵作用，已成為該領域研究的熱點[6]。SIRT1為沉默信息調節因子蛋白家族成員，作為高度保守的基因亞家族，可編碼NAD+依賴的蛋白脫乙酰酶[7]。SIRT1通過調控多重底物蛋白間的平衡而調節細胞衰老、葡萄糖代謝等多種細胞反應[8]。研究者發現，隨年齡增長血清SIRT1水平持續下降，在老年癡呆等神經系統疾病患者中血清SIRT1水平下降速度明顯增加[9]；提示SIRT1可能為多種老年性疾病的潛在標志物。本研究顯示，COPD穩定期和急性加重期患者血清SIRT1濃度以及外周血單核細胞SIRT1 mRNA和蛋白表達水平較對照組明顯下降，且急性加重期患者下降更明顯；相關性分析顯示，SIRT1 mRNA和蛋白表達水平與氣道阻塞指標FEV1/FVC和氣道阻塞嚴重程度指標FEV1%均呈正相關，提示SIRT1表達水平隨COPD進展逐漸下降，在病情發展中可能發揮調控作用，可作為評估病情嚴重程度的生物學指標。

炎癥細胞因子和介質引發的慢性炎癥反應是COPD發病的主要機制。研究者發現，SIRT1能夠通過與不同類型的靶蛋白結合來響應胞外刺激，參與COPD的發生、發展，但具體分子機制仍未完全闡明[10]。相關研究顯示，不同時期COPD患者中均存在NF-κB激活，且與病情發展密切相關[11]。本研究中COPD穩定期和急性加重期患者血清NF-κB濃度以及外周血單核細胞NF-κB mRNA和蛋白表達水平明顯高于對照組，且急性加重期患者明顯高于穩定期患者；且NF-KB與SIRT1 mRNA和蛋白表達水平呈負相關，提示SIRT1可能對NF-κB具有調控作用，SIRT1表達下調與NF-κB活性增加明顯相關。

研究者發現，MMP-9在胞外基質破壞中發揮作用，與支氣管哮喘、肺癌等多種疾病的發生、發展密切相關[12]。本研究顯示，COPD穩定期和急性加重期患者血清MMP-9濃度以及外周血單核細胞MMP-9 mRNA和蛋白表達水平明顯高于對照組，且急性加重期患者明顯高于穩定期患者。動物實驗顯示，經氧化應激誘導的大鼠體內SIRT1表達下降可提升MMP-9表達水平[13]。本研究中COPD患者中MMP-9與SIRT1 mRNA和蛋白表達水平呈負相關，結合既往研究結論推測，SIRT1可能通過對NF-κB、MMP-9的調節作用來調控COPD的發生與發展，其中具體的分子機制仍需進一步深入研究。