高效液相色譜法測定花生仁中甲咪唑煙酸殘留

黃志勇 ，李汶鮮 ，陳艷 ，鄒沫君 ，景贊 ，劉超

（1.四川省樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川樂山614000；2.四川省樂山市沙灣區綏山初級中學，四川沙灣614900）

隨著除草劑范轉及使用量的增大，其在農作物中的殘留，以及對人類健康和環境造成的毒害，也越來越被人們所關注[1,2]。甲咪唑煙酸（Imazapic）是一種咪唑啉酮類花生專用除草劑[3]。該類除草劑由于淋溶性強，易污染地下水，同時在土壤中殘留時間較長，容易對后茬作物造成傷害[4,5]。我國對甲咪唑煙酸在部分農產品中的殘留做出了嚴格的限量要求[6]。

目前針對花生仁中甲咪唑煙酸農藥殘留定量檢測的標準方法是在GB 2763-2016標準中規定的參照GB 23200.13-2016的方法，該方法采用的是液相色譜-質譜測定茶葉中的多種農藥殘留[7]。花生仁基質因含有大量的油脂和蛋白質，因此與測定茶葉基質的方法有顯著的區別，而且該方法僅僅是對甲咪唑煙酸的定性檢測，標準峰出現了較為嚴重的肩峰。本試驗在前人工作的基礎上[8,9]，根據花生仁樣品和甲咪唑煙酸性質結合文獻資料分析[10]，建立了以乙腈：0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（加入0.1%的三乙胺，磷酸調pH3.0）體積比1：3作為流動相，采用實驗室普及率較高的高效液相色譜（紫外檢測器）定量檢測其殘留量。該方法操作簡便、分離度好、結果準確，能很好地應用在對花生仁中甲咪唑煙酸殘留量的定量檢測上。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲咪唑煙酸（98.5%），德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、乙腈，色譜純，北京北靈威科技有限公司；正己烷（色譜純），成都市科龍化工試劑廠；三乙胺，色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；無水硫酸鈉，分析純，成都市科龍華試劑廠；磷酸二氫鉀、磷酸，分析純，成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

小型高速粉碎機，永康市天祺盛世工貿有限公司；CP225D電子天平，德國賽多利斯公司；TG-16臺式高速離心機，四川蜀科儀器有限公司；組織搗碎勻漿儀，江蘇金壇市環宇科學儀器廠；UPT-Ⅱ-10T超純水機，四川優普超純科技有限公司；多參數測試儀，梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；EV331旋轉蒸發儀，萊伯泰科有限公司；島津LC-20A高效液相色譜儀（配SPD-20A紫外檢測器），日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制

以甲醇為溶劑，配置濃度分別為 0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2 mg/L的甲咪唑煙酸標準系列溶液。經0.22 μm的有機微孔膜過濾，再進行HPLC分析，以甲咪唑煙酸質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取15 g勻漿后的花生仁樣品于50 mL具塞離心管中，加入5 g無水硫酸鈉、20 mL乙腈，在高速組織搗碎機上以15 000 r/min勻漿提取1 min，4 000 r/min離心5 min，上清液移入50 mL具塞離心管中。殘渣再加20 mL乙腈重復提取1次，上清液并入50 mL具塞離心管中。向其中加入5 mL乙腈飽和的正己烷溶液，劇烈振搖1 min，靜置分層，棄去上層正己烷溶液，取30 mL乙腈溶液于雞心瓶中，50℃水浴，旋轉濃縮至干，加入20%甲醇水溶液2 mL溶解，經0.22 μm有機微孔濾膜過濾，進行HPLC分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：Thermo C18不銹鋼柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A為乙腈，B為0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液，其中加入0.1%的三乙胺，磷酸調pH 3.0，A、B的體積比為 1：3；等度洗脫，流速為 0.8 mL/min；柱溫 25 ℃；進樣體積5 μL；檢測波長280 nm；外標法定量。

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇

流動相的組成成分各自的性質和濃度對目標物的色譜峰型和分離存在密切的關系。按照GB/T 23200.13-2006標準使用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為混合流動相時，按照1.4色譜條件進行分析，標準峰出現與上述國標類似的峰型較寬且存在不對稱的情況。為此，根據甲咪唑煙酸結構特點結合相關文獻，采用乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（加入0.1%的三乙胺，磷酸調pH3.0）體積比1：3作為改良流動相進行分析，結果顯示標準峰型對稱、峰寬較窄，如圖1所示。

圖1 甲咪唑煙酸對照品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of imazapic standard

2.2 標準曲線和檢出限

按照1.4色譜條件對甲咪唑煙酸標準系列質量濃度進行測定，以標準峰面積（A）為縱坐標，標準系列質量濃度C（mg/L）為橫坐標，繪制標準曲線并作線性回歸。得到的線性方程為A=9091.4C-47.816，線性相關系數R2=0.9999。在該法條件下甲咪唑煙酸的最小檢出量為0.2 ng，方法檢測限為 7 μg/kg。

2.3 方法學考察

2.3.1 重復性

以甲咪唑煙酸對照品加標濃度為0.1 mg/kg的陰性樣品作為供試品溶液，平行制備6份，按照1.3.2的樣品前處理，1.4色譜條件測定每份供試品的含量，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計算得甲咪唑煙酸的含量分別為0.098 3、0.098 5、0.097 7、0.098 6、0.099 1、0.098 1 mg/kg，RSD為0.49%，說明該方法重復性良好。

2.3.2 精密度

以甲咪唑煙酸濃度為0.01 mg/kg標準溶液做精密度測試，按照1.4色譜條件重復進樣6次，記錄峰面積分別為 406、394、407、396、397、407，RSD 為 1.6%，說明該方法精密度良好。

2.3.3 穩定性

以甲咪唑煙酸對照品加標濃度為0.1 mg/kg的陰性樣品作為供試品溶液，分別放置0、2、4、8、12 h后按照1.3.2處理，1.4色譜條件測定不同穩定時間供試品溶液中甲咪唑煙酸的含量分別為0.098 5、0.098 6、0.098 4、0.097 8、0.097 4 mg/kg，RSD為0.53%，說明該方法在12 h內穩定性良好。

2.3.4 加標回收率

準確稱取未檢出甲咪唑煙酸的陰性花生仁樣品18份，將其分成3組，添加相當于樣品含甲咪唑煙酸濃度分別為0.45、0.9、1.8 mg/kg的標準溶液，按本法進行提取、凈化處理，分別做6次平行實驗。對比陰性樣品色譜圖標準峰與雜質峰實現了很好的分離。各添加質量濃度平均回收率結果見表1所示，平均回收率在91.1%～98.9%之間，相對標準偏差（RSD）為0.43%～0.63%。結果表明該方法的回收率能滿足測定要求。

表1 各添加量的平均回收率結果和RSD（n=6）Table 1 Addition standard recovery and RSD（n=6）

2.4 樣品的檢測

用上述方法測定了隨機從當地超市購買的不同產地的花生仁樣品10份，均未檢出甲咪唑煙酸殘留。

3 結論

建立了一種簡便的高效液相色譜法檢測花生仁中甲咪唑煙酸的方法。本方法對GB/T23200采用的乙腈-0.1%甲酸水溶液流動相進行了探討，確定了乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（加入0.1%的三乙胺，磷酸調pH為3.0）（體積比1：3）作為新流動相，實現了對標準峰型的優化和與雜質峰的分離。結果表明，甲咪唑煙酸標準溶液在0～1.2 mg/L范圍內線性良好（R2=0.9999），檢出限為7 μg/kg。經過方法學的考察，其重復性、精密度、穩定性較好，并且在花生仁中甲咪唑煙酸標準限值（0.1 mg/kg）附近添加三個不同濃度分別為0.045、0.09、0.18 mg/kg，獲得了 91.1%～98.9%的回收率，RSD為 0.43%～0.63%，適用于花生仁中甲咪唑煙酸殘留量的定量檢測。