正交設計優選黃芪總黃酮提取工藝

梁泰帥 趙肖瓊2 馮 美

1.山西醫科大學藥學院，山西 太原 030001；2.太原工業學院環境與安全工程系，山西 太原 030008

黃芪是山西的一種重要道地藥材，始載于《神農本草經》，味甘、性溫，具有補氣固表、排膿降壓、提高機體免疫力等功效，素有“十藥八芪”之稱[1]。黃酮類化合物是黃芪發揮功效的主要物質基礎和有效部位，可作為抗氧化劑在清除活性氧自由基、抗菌消炎、延緩衰老、抗過敏等方面有著顯著的藥理活性，并已在臨床防治老年高血壓、冠心病和視網膜出血等疾病方面有著廣泛的應用[2-3]。因此，優化黃芪總黃酮的提取工藝對其藥理學作用的深入探究意義重大。本研究分別對乙醇濃度、水浴溫度、料液比和提取時間4個因素進行單因素試驗，確定四因素三水平，設計L9(34)正交試驗，考察黃芪總黃酮提取的最優工藝參數，以期為黃芪資源的合理開發以及臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試藥 蒙古黃芪藥材飲片(山西渾源萬生黃芪開發有限公司)；蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201610)；95%乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉等試劑均為分析純。

1.2 儀器 電熱鼓風干燥箱(GZX-9070MBE，上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；中藥材粉碎機(FW177，天津市泰斯特儀器有限公司)；萬分之一天平(BSA224S-CW，賽多利斯科學儀器北京有限公司)；數顯恒溫水浴鍋(HH-2，國華電器有限公司)；循環水式真空泵[SHZ-D(Ⅲ)，上海予申儀器有限公司]；紫外可見分光光度計(UV-1200，上海美譜達儀器有限公司)；低速大容量多管離心機(LXJ-IIB，上海安亭科學儀器廠)。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標準曲線的制作 蘆丁標準曲線的制作參照張浩等[3]的方法，稍作改進：準確稱取在105℃干燥至恒重的蘆丁對照品25 mg于100 mL容量瓶中，加70%乙醇定容，得到質量濃度為0.25 mg/mL的蘆丁標準液。分別準確吸取蘆丁標準液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于7只10 mL容量瓶中，然后分別添加3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0 mL的蒸餾水；再向各瓶內添加5%的NaNO2溶液 0.3 mL，混勻并靜置6 min；繼續添加10%的Al(NO3)2溶液 0.3 mL，混勻并靜置6 min；再添加4%的NaOH溶液4 mL，最后用70%的乙醇定容至10 mL，混勻并靜置12 min，依次在510 nm處測定各瓶內反應液的吸光值，以吸光值Y和蘆丁質量濃度X分別作為縱坐標和橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程為：Y=0.6804X-0.0012，相關系數R2=0.9998。

1.3.2 精密度試驗 準確吸取蘆丁標準液1.5 mL于10 mL容量瓶中，按照“1.3.1”項下方法測定吸光值，重復測定6次，計算出RSD為0.481%，表明精密度良好。

1.3.3 穩定性試驗 供試品溶液制備[4]：將黃芪藥材于60℃烘干至恒重，粉碎后過50目篩。精確稱取黃芪粉末5 g于圓底燒瓶中，加入10倍量90%乙醇，70 ℃水浴下回流提取2次，每次2 h，趁熱減壓抽濾2次，合并濾液，5000 r/min離心5 min，上清液即為供試品溶液。

準確吸取供試品溶液1.5 mL于10 mL容量瓶中，按照“1.3.1”項下方法分別于0、15、30、45、60、90、120 min測定吸光值，計算出RSD為1.176%，表明供試品溶液在2 h內穩定。

1.3.4 重復性試驗 精確稱取黃芪粉末共6份，按照“1.3.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，各取1.5 mL于10 mL容量瓶中，按照“1.3.1”項下方法測定吸光值，計算出RSD為0.912%，表明此方法重復性較好。

1.3.5 加樣回收試驗 準確稱取已知含量(5.198 mg/g)的黃芪粉末6份，各約2.5 g，按照“1.3.3”項下方法制備供試品溶液，再分別精確加入適量蘆丁標準液，混勻后按照“1.3.1”項下方法進行測定，計算出平均回收率為99.81%，RSD為0.805%。結果見表1。

表1 總黃酮加樣回收率試驗結果

1.3.6 單因素試驗 根據參考文獻和預試驗結果分別設計以下單因素試驗組合：①乙醇濃度為50%、60%、70%、80%和90%，水浴溫度為70 ℃，料液比為1∶10，提取時間為2 h；②水浴溫度為60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃，乙醇濃度為90%，料液比為1∶10，提取時間為2 h；③料液比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12和1∶14，乙醇濃度為90%，水浴溫度為70 ℃，提取時間為2 h；④提取時間為1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h，乙醇濃度為90%，水浴溫度為70 ℃，料液比為1∶10，分別考察以上各試驗條件對黃芪總黃酮提取率的影響。

1.3.7 正交試驗設計 依據“1.3.3”項單因素試驗結果，以黃芪總黃酮提取率為考量指標，設計L9(34)正交試驗，選定的正交試驗因素水平見表2。

表2 正交試驗因素水平

1.4 數據分析 分別采用SPSS 18.0和Origin9.0軟件進行正交試驗數據分析檢驗和繪圖。計算公式為[5]：

總黃酮提取率=(C×V)/(M×1000)×100

式中：C表示由標準曲線得到提取液中總黃酮的質量濃度(mg/mL)，V表示濾液體積(mL)，M表示黃芪粉末質量(g)，×1000表示g與mg的單位轉換。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗 圖1顯示，隨著乙醇濃度、水浴溫度、料液比和提取時間的增加，黃芪總黃酮的提取率均呈先升高后降低的趨勢，且分別在乙醇濃度為80%、水浴溫度為90 ℃、料液比為1∶10和提取時間為2.5 h時，總黃酮提取率達到最大值。因此，選擇乙醇濃度70%、80%和90%，水浴溫度為80 ℃、90 ℃和100 ℃，料液比為1∶8、1∶10和1∶12，提取時間為2 h、2.5 h和3 h進行正交試驗。

2.2 正交試驗 由表3中R值(極差)可知，對黃芪總黃酮提取率影響的主次因素依次為料液比、乙醇濃度、水浴溫度和提取時間。從表中K1、K2、K3的大小分析得出，黃芪總黃酮的最優提取工藝參數為A3B1C3D1，即乙醇濃度為90%、水浴溫度為80℃、料液比為1∶12、提取時間為2 h。此外，從表4方差分析結果可知，乙醇濃度(P<0.001)、水浴溫度(P<0.01)、料液比(P<0.001)和提取時間(P<0.05)均顯著影響黃芪總黃酮的提取率。

2.3 驗證試驗 為驗證組合A3B1C3D1為最優提取方案，在此條件下，平行試驗3次，試驗結果見表5，可以看出，在此最優提取條件下，黃芪總黃酮的平均提取率為0.286%，均高于單因素試驗和正交試驗結果，驗證了正交試驗設計優化結果的準確性，表明該提取工藝參數A3B1C3D1(即乙醇濃度為90%、水浴溫度為80℃、料液比為1∶12、提取時間為2 h)合理可行，為黃芪總黃酮最優提取方案。

表3 正交試驗設計及結果

表4 方差分析結果

注：*，差異顯著水平為P<0.05；**，差異顯著水平為P<0.01；***，差異顯著水平為P<0.001。

表5 驗證正交試驗結果

3 討論

相比于微波輔助萃取法、超聲波提取法、超臨界CO2萃取法等，黃酮類物質的乙醇回流提取法操作簡便、效率較高、溶劑可回收、運行成本低，能夠同時兼顧提取效率和工業化生產[4,6]。本試驗選擇乙醇回流提取法進行黃芪總黃酮提取，通過單因素試驗和正交試驗相結合的方法研究乙醇濃度、水浴溫度、料液比和提取時間4個因素對黃芪總黃酮提取率的影響，并通過直觀分析和方差分析綜合考察，確定黃芪總黃酮提取的最優工藝參數[6]。單因素試驗結果發現，黃芪總黃酮提取率均隨乙醇濃度、水浴溫度、料液比和提取時間的增加呈先升高后降低趨勢，表明影響總黃酮提取率的4個因素在選定范圍內均存在顯著最佳值，當各影響因素設定水平高于最佳值時，較高濃度的乙醇溶液使藥材中的低極性雜質易于滲出[5]，造成類黃酮提取效率降低，高溫可破壞類黃酮類化合物的分子結構[4]，而料液比和提取時間的增加又導致生產成本以及提取周期提高[7]；反之，當各影響因素設定水平低于最佳值時，導致黃酮類物質的滲透、溶解和擴散效率降低[8]，浸提物提取不充分。

試驗研究結果表明，對黃芪總黃酮提取率影響的主次因素依次為料液比>乙醇濃度>水浴溫度>提取時間，同時總黃酮的最優提取工藝參數為A3B1C3D1，即乙醇濃度為90%、水浴溫度為80℃、料液比為1∶12、提取時間為2 h，該提取條件下，黃芪總黃酮提取率為0.286%。此方法操作簡便、穩定合理，可作為黃芪總黃酮的最優提取工藝參數。