姜黃素抗草酸鈣結晶致大鼠腎損傷的機制研究

江 濤，毛厚平，何彥豐，陳文煒，高星健，張 華

腎結石外科治療手段日益多樣化，但目前仍沒有預防其發生和復發的有效方法。腎結石最常見的成分是草酸鈣結石[1]。已知有多種因素在多個環節參與草酸鈣腎結石的生成。研究認為，高草酸尿能誘導活性氧(reactive oxygen species,ROS)產生，損傷腎小管上皮細胞，并誘導細胞膜磷脂酰絲氨酸結構發生改變，促使草酸鈣結晶粘附于腎小管上皮細胞表面[2]；而后受損細胞逐步變為碎片，接著大分子物質迅速牢固粘附，最終啟動結石形成的級聯反應。近年來，核因子E2相關因子-2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF-2)誘導血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase,HO-1)的表達被認為是細胞內最重要的內源性抗氧化應激機制之一。上調此信號通路可維持細胞內的氧化還原狀態，發揮細胞保護作用[3]。

許多中藥成分可通過上調NRF-2/HO-1通路阻斷氧化應激發生。姜黃素為中藥姜黃的重要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、減慢鈣沉積速率的生物活性[4]。本研究采用乙醛酸鹽腹腔注射方法建立大鼠腎草酸鈣結晶模型，觀察姜黃素干預對腎結石形成的影響，并通過大鼠相關生化指標、腎臟組織氧化應激指標及腎小管上皮細胞凋亡情況評價造模情況和治療效果，探討姜黃素對大鼠草酸鈣結晶性腎損傷模型的保護性作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 雄性C57BL/6大鼠40只，7～8周齡，體質量(225±25)g，由福建醫科大學實驗動物中心提供(許可證號:SCXK2012-0003)。大鼠常規飼料喂養，正常飲水，飼養房溫度為(20±3)℃，濕度為35%～55%，光照10 h/d。

1.1.2試劑和儀器 試劑：乙醛酸鹽[梯希愛(上海)化成工業發展有限公司]；姜黃素、橄欖油及丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術公司)；腎臟細胞凋亡DNA片段測定試劑盒、兔NRF-2及HO-1多克隆抗體(美國Sigma公司)；馮庫薩(VON KOSSA)染色試劑盒(上海生工生物工程技術有限公司)；蛋白印跡發光試劑盒(美國Cell Signaling公司)；BCA法蛋白濃度測定試劑盒(中國碧云天公司)。儀器：超低溫冰箱(U85-13型，美國Thermo公司)；自動生化分析儀(Aul000型，日本Olympus公司)；核酸蛋白分析儀(DU-800型，德國Beckman公司)；穩壓垂直電泳儀(Powerpac通用型，美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組及模型制作 采用系統隨機化法將40只大鼠均分為5組：(1)空白對照組：自由飲用去離子水+橄欖油1 mL灌胃；(2)單純結晶組(模型組)：100 mg·kg-1·d-1乙醛酸鹽腹腔注射+橄欖油1 mL灌胃；(3)低、中、高劑量姜黃素干預+結晶組：100 mg·kg-1·d-1乙醛酸鹽腹腔注射+姜黃素20，40和60 mg·kg-1·d-1橄欖油溶液1 mL灌胃[5]。

1.2.2尿液和血液生化指標檢測 分組干預4周后，將各組大鼠放入代謝籠中，收集每只大鼠24 h尿液，抽取全血樣本。應用生化分析儀檢測尿離子鈣濃度以及血清肌酐(serum creatinine,SCr)濃度。分別采用鉻酸鉀氧化甲基紅催化光度法測定尿草酸。

1.2.3腎臟組織相關檢測 留取血、尿樣本后，處死大鼠，取雙側腎臟，稱取質量。將一側腎臟制作切片，一部分經VON KOSSA染色觀察腎組織鈣鹽的分布，并計算腎結晶沉淀評分。評分標準：無結晶沉積為0分；結晶位于腎髓質為1分；結晶位于皮質與髓質交界處為2分；結晶位于皮質部為3分；如果結晶多部位存在，則各部位分值相加得出單個腎臟鈣鹽結晶分值。另取一部分切片采用免疫組織化學細胞凋亡染色(TUNEL法)觀察腎小管上皮細胞的凋亡情況，每一張切片至少計數500個細胞，計算陽性細胞數，以百分數表示凋亡指數。

1.2.4腎臟MDA含量和HO-1活性檢測 取部分腎臟組織勻漿，采用比色法測定腎臟組織的MDA含量，具體操作步驟按照MDA測試盒說明進行。另取部分勻漿，測定樣品反應物中的膽紅素生成量，代表HO-1活性。冰上勻漿，4 ℃下離心20 min，取上清100 μL，分別加入膽綠素還原酶4 mg以及還原型輔酶Ⅱ，加入pH為7.4的磷酸鉀緩沖液至1 mL，充分混勻，37 ℃水浴，避光反應20 min，冰浴終止反應。測定波長為463和530 nm的吸光度差值，以膽紅素生成量反映HO-1活性。

腎臟組織MDA含量(nmol/mg pro)=(A測定管-A標準空白管)÷(A標準管-A標準空白管)×標準品濃度(10 nmol/mL)÷樣本蛋白含量(mg pro/mL)

HO-1活性(nmol·mg-1·h-1)=[(A460-A530)/(蛋白含量×40)]×106

1.2.5Western-blot檢測腎臟NRF-2和HO-1蛋白的表達 提取胞內蛋白，沸水浴使蛋白質變性，各組蛋白和Marker分別上樣后行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，后轉移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉封閉5 h后與兔抗NRF-2多克隆抗體(1∶500)、兔抗HO-1多克隆抗體(1∶2 000)和β-actin抗體結合，4 ℃過夜，洗膜后雜交2 h，顯影。通過掃描儀灰度掃描后，用Quantity one 4.6.6版圖像分析軟件進行分析，以相應蛋白條帶的平均光密度值與內參照β-actin的相應條帶灰度值的比值表示NRF-2及HO-1的含量相對值。

2 結 果

2.1姜黃素對各組大鼠尿離子鈣和尿草酸表達濃度的影響 模型組大鼠的尿離子鈣和尿草酸濃度比空白對照組大鼠顯著升高(P<0.05)，說明造模成功。姜黃素干預組大鼠的尿離子鈣濃度和尿草酸與模型組比較，差別均無統計學意義(P>0.05，表1)。

2.2姜黃素對各組大鼠SCr濃度的影響 模型組大鼠的SCr濃度比空白對照組顯著升高(P<0.05)；隨著姜黃素干預劑量的增加，姜黃素干預組大鼠的SCr水平呈下降趨勢，與模型組比較，差別均有統計學意義(P<0.05)，各干預組間差別也有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.3姜黃素對各組大鼠腎臟組織相關檢測指標的影響

2.3.1腎小管上皮細胞凋亡指數 模型組大鼠的腎小管上皮細胞凋亡指數比空白對照組顯著升高(P<0.05)；隨著姜黃素干預劑量的增加，姜黃素干預組大鼠的腎小管凋亡指數逐漸降低，與模型組比較，差別均有統計學意義，各干預組間差別也有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.3.2腎臟草酸鈣結晶形成情況 光學顯微鏡觀察發現，模型組大鼠腎臟組織中見大量黑色鈣鹽結晶呈片狀連接，在腎皮質、髓質及乳頭均可見，結晶沉淀評分結果與空白對照組比較差別有統計學意義(P<0.05)。而姜黃素干預組大鼠僅在腎小管腔及皮質與髓質交界處出現黑色鈣鹽結晶，且隨著干預劑量的增加，結晶逐漸減少，結晶沉淀評分結果各干預組與模型組比較，差別均有統計學意義(P<0.05)，各干預組間差別也有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.3.3腎臟組織中MDA含量和HO-1活性 模型組大鼠腎臟組織中MDA含量比空白對照組明顯升高(P<0.05)，而HO-1活性比空白對照組明顯下降(P<0.05)。隨著姜黃素干預劑量的增加，各干預組大鼠腎臟組織中MDA含量呈下降趨勢，而HO-1活性呈升高趨勢，與模型組比較，差別均有統計學意義(P<0.05)，各干預組間差別也有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.3.4腎臟組織中NRF-2和HO-1蛋白 模型組大鼠腎臟組織中NRF-2和HO-1蛋白均比空白對照組明顯降低(P<0.05)。隨著姜黃素干預劑量的增加，各干預組大鼠腎臟組織中NRF-2和HO-1蛋白表達水平呈升高趨勢，與模型組差別均有統計學意義，各干預組間差別也有統計學意義(P<0.05，圖1，表1)。

3 討 論

對于潛在的可能罹患結石的高風險患者，在未進展至臨床腎結石之前，其體內可能已存在因氧化應激狀態異常而導致的腎小管上皮損傷。當組織細胞中氧化應激持續產生及活性氧簇生成過多時，刺激腎小管上皮細胞的細胞膜脂質過氧化，產生氧自由基，導致腎小管上皮細胞受損[6]。受損細胞為早期微石形成提供有效結合點，促進腎臟小管上皮與結晶體的粘附、聚集及生長，最終啟動結石生成級聯反應[7]。MDA是膜脂過氧化的終產物之一，可以導致膜脂過氧化，損傷生物膜結構，使得細胞膜結構和功能受到損傷，是考察細胞受氧化應激嚴重程度的指標之一。Hirose等在大鼠草酸鈣腎結晶模型上發現MDA的脂質過氧化作用比正常大鼠明顯升高[8]。本研究表明，乙醛酸鹽誘導大鼠MDA和SCr明顯升高，提示其腎小管上皮細胞發生脂質過氧化，導致腎功能受損；姜黃素干預則可顯著降低MDA和SCr水平，且成劑量依賴關系，這可能與其具有抗脂質過氧化功能有關[9]。姜黃素具有抗氧化、抗炎和抗自由基作用。本研究結果也證實，姜黃素在一定程度上保護腎小管上皮細胞免受氧化應激損傷，從而阻止草酸鈣結晶進一步聚集形成結石。多項研究表明，姜黃素對乙二醇誘導的腎臟草酸鈣結石形成具有明顯預防效果[4,10]。

1：空白對照組；2：模型組；3～5：低、中、高劑量姜黃素(20，40，60 mg·kg-1·d-1)干預組.NRF-2：核因子E2相關因子2；HO-1：血紅素加氧酶-1.圖1 Western-blot檢測各組大鼠NRF-2和HO-1蛋白表達情況Fig 1 NRF-2 and HO-1 protein expression of rats in each group detected by Western-blot

表1 各組大鼠生化、氧化應激和凋亡指標檢測結果Tab 1 Examination parameters of rats on biochemical,oxidative stress and apoptosis indexes in each group

n=8.MDA：丙二醛；HO-1：血紅素加氧酶-1；NRF-2：核因子E2相關因子-2.與空白對照比較，▲：P<0.05；與模型組比較，☆：P<0.05；與20 mg·kg-1·d-1姜黃素組比較，△：P<0.05；與40 mg·kg-1·d-1姜黃素組比較，○：P<0.05.

NRF-2是具有基本亮氨酸拉鏈結構的核轉錄因子。目前認為，NRF-2是調控細胞對抗氧化損傷的關鍵轉錄因子。NRF-2通過與抗氧化反應元件結合而啟動HO-1基因轉錄，阻斷脂質過氧化物的發生和發展，從而對抗脂質過氧化物產生的細胞損害作用。而HO-1是細胞對于氧化應激的適應反應，能有效消除氧自由基，抑制細胞脂質過氧化和NADPH氧化活性，減輕線粒體損傷，保護內皮細胞免受過氧化物侵害引起的細胞凋亡[11]。本研究發現，當連續給予大鼠乙醛酸鹽干預4周后，模型組的MDA、SCr和腎結晶程度均比對照組明顯升高，提示模型組大鼠體內存在較高的氧化應激狀態及鈣代謝異常，高濃度尿草酸可誘導腎臟組織產生氧化應激損傷，造成腎小管上皮細胞膜過氧化，使細胞凋亡、脫落，基膜暴露，致使草酸鈣結晶粘附其表面，啟動結石形成。這與Bodakhe等的研究結果一致[12]。研究同時發現，模型組大鼠的NRF-2及HO-1的表達水平均較對照組大鼠顯著下降，原因可能是機體對抗氧化應激的自我保護反應逐漸消耗衰減，最終導致腎小管上皮細胞的損害及凋亡以及腎功能的損害。研究發現，姜黃素雖然無法降低尿草酸水平，但大鼠NRF-2及HO-1的表達水平均較模型組組明顯上升，且隨著姜黃素濃度的增加，大鼠腎小管上皮細胞損傷程度、腎結晶程度、尿中尿素氮及SCr的上升水平和大鼠NRF-2及HO-1表達水平的下降趨勢均較模型組明顯延緩。

本研究表明，姜黃素可通過上調NRF-2/HO-1蛋白表達，增強上游NRF-2和下游HO-1的表達，減輕大鼠草酸鈣結晶引起的氧化應激腎損傷，保護腎小管上皮細胞，減少草酸鈣結晶形成。但姜黃素的作用機制還可能涉及更多的通路環節，仍需進一步探討。