小麥Sec24基因的不同亞型在不同組織中的初步表達分析

張杰鈺，劉思農，洪思丹，伏 歡，冉莉萍

(揚州大學廣陵學院，江蘇 揚州 225000)

1 引言

小麥(TriticumaestivumL.)是一種重要的糧食作物，在世界各地廣泛種植。我國是小麥的種植大國，小麥的種植面積和產量僅次于水稻(OryzasativaL.)。小麥籽粒中的貯藏物質主要是淀粉和蛋白質，二者分別在胚乳的淀粉體和蛋白體兩種細胞器中積累。目前關于淀粉體發育的機理已經研究清楚。但關于小麥胚乳蛋白體的發育過程較為復雜，隨著對貯藏蛋白研究的不斷深入，人們普遍認為小麥胚乳蛋白體的形成方式有兩種，一種是內質網衍生途徑，即合成的蛋白質聚集在內質網中出芽生成蛋白體；另一種是高爾基體小泡形成途徑，即蛋白質在內質網上合成后先經過高爾基體隨后運輸到蛋白質貯藏液泡(protein storage vacuole, PSV)中積累形成蛋白體。這兩種途徑形成的蛋白體其成分不同：通常內質網衍生途徑形成的蛋白體中富含HMW-GS，而高爾基體小泡形成途徑合成的蛋白體主要聚集LMW-GS和醇溶蛋白。

其中蛋白質從內質網到高爾基體的轉運過程主要依賴細胞質中包被蛋白復合體II(coat protein complex II, COPII)介導完成。COPII小泡由5種高度保守的蛋白質構成：胞質GTP酶Ras相關蛋白1(Sar1)、內衣被組分Sec23和Sec24及外衣被組分Sec13和Sec31。隨著對COPII小泡研究的不斷深入，人們發現Sec24表面分布有多個運輸物質結合位點，可以和運輸物質的信號肽相互作用，進而將運輸物質招募到初期小泡中，它會在COPII小泡介導的蛋白質運輸過程中發揮重要作用。Nakano等在不同物種里Sec24有不同數量的亞型，例如，酵母有兩個：Iss1/Sfb2和Lst1/Sfb3；擬南芥有三個：Sec24a、Sec24b和Sec24c，每個亞型的功能非冗余且作用不可忽視。近年來人們陸續展開對Sec24的研究，其中研究最多的是Sec24a亞型。最新的系統發育分析結果表明，與COPII小泡的其它組分相比，Sec24a亞型的多樣性程度最高。而小麥中關于Sec24基因的研究鮮有報道。在前期研究工作中本課題組對施氮前后的小麥胚乳進行了轉錄組測序，發現小麥Sec24基因有3個亞型，分別是Sec24a、Sec24b和Sec24c，其中Sec24a受氮素影響顯著，它的表達水平與蛋白含量呈正相關。當蛋白質含量升高時，小麥Sec24a基因的表達水平會發生顯著的變化。本研究通過半定量RT-PCR和實時熒光定量PCR對揚麥158的根、幼葉、葉鞘、成熟葉、小穗和籽粒等組織中Sec24基因三個基因亞型的表達量差異進行初步分析，以期為后續探明Sec24a基因對胚乳蛋白體發育和貯藏蛋白積累的分子調控奠定理論基礎。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

供試材料為中筋小麥品種“揚麥158”，種子由揚州市里下河地區農科所提供。分別取幼苗期的根、莖與葉，花粉發育期的幼穗與葉和結實期的穎果(花后8 d)所有樣品經液氮速凍后，置于-80 ℃超低溫冰箱保存用于RNA提取。

2.2 總RNA提取和cDNA的合成

根據Plant Total RNA Purification Kit試劑盒說明書提取總RNA。用1.5%濃度的瓊脂糖凝膠檢測RNA片段的完整性，經質檢合格后，-70 ℃保存備用。

以總RNA為模板，按照RevertAidTM First Strand cDNA Kit反轉錄試劑盒說明書取進行反轉錄。反轉錄體系包括：20～50 μg總RNA、1 μL Oligo (dT)18；12μL RNase-free的水將之補至12 μL、4 μL 5×RT Buffer、1 μLRNase Inhibitor、2 μL dNTP mix、1 μL Reverse Transcriptase。反轉錄程序為：42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min, 反應結束后將反轉錄得到的cDNA模板放至-20 ℃冰箱中保存。

2.3 半定量PCR(Reverse Transcription PCR，RT-PCR)和實時熒光定量PCR分析(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)

表1為RT-PCR和qRT-PCR的反應引物序列。Actin基因PCR程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。分別以Sec24的三個亞型的基因序列設計的擴增引物進行擴增，RT-PCR反應程序為：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 循環；72 ℃10 min；4℃保存。

qRT-PCR的反應體系共10 μL，主要包括：cDNA稀釋液(模板)1 μL，正反向引物各0.3 μL，AceQ qPCRSYBR Green Master Mix 5 μL(Vazyme)，ROX Reference Dye1 0.3 μL，滅菌蒸餾水補足至10 μL。qRT-PCR反應程序為：95 ℃變性1 min，95 ℃(15 s)，60 ℃(30 s)，72 ℃(30 s)，總的40個循環反應。整個反應是在正常運行的Stratagene Mx 3000P儀器上進行。通過溶解曲線來判斷引物的特異性和可用性，采用2-△△CT法來分析每一個基因的相對表達量。

表1 各基因及內參基因RT-PCR和qRT-PCR引物序列

3 結果與分析

3.1 基于半定量RT-PCR對Sec24基因的不同亞型的初步表達分析

我們分別對小麥不同器官中Sec24基因的三個亞型Sec24a、Sec24b和Sec24c的表達量進行了半定量RT-PCR分析，結果見圖1。從圖1中可以看出，Sec24的三個亞型并非是特異性表達的基因，它在小麥的各個器官中均會表達，在根中表達量較高，在旗葉中的表達量最低，尤其是Sec24a基因亞型在旗葉中的表達最少，Sec24c次之。根據圖中條帶的明暗程度來看，Sec24a基因亞型在不同組織中的表達程度比Sec24b和Sec24c兩個基因型的要低。

3.2 基于qRT-PCR對Sec24基因不同亞型的初步表達分析

qRT-PCR分析結果(圖2)表明，Sec24的三個基因亞型(Sec24a、Sec24b和Sec24c)在不同器官中均檢測到有表達，但表達量高低存在明顯差異，從整體水平上看，Sec24a在各器官中的相對表達量要低于Sec24b和Sec24c。分別對不同組織中的同一個基因亞型進行分析，發現Sec24a基因亞型在不同組織中的表達量為：根>花后28d小麥穎果>花后8d小麥穎果>花后18d小麥穎果>莖>幼穗>旗葉；Sec24b基因亞型為：根>花后28d小麥穎果>幼穗>花后8d小麥穎果>莖>花后18d小麥穎果>旗葉；Sec24c基因亞型為：根>花后18d小麥穎果>花后8d小麥穎果>花后28d小麥穎果>莖>幼穗>旗葉。從圖2中可以看出，三個基因亞型均在根中的表達量最高，旗葉中的表達量最低，尤其是Sec24c基因型最為明顯，該結果與圖1所示的相對表達量一致。

圖中A 花后8 d小麥穎果；B花后18 d小麥穎果；C花后28 d小麥穎果；D旗葉；E莖；F幼穗；G根；Ta54825為內參基因

圖1小麥Sec24基因的三個亞型Sec24a、Sec24b、Sec24c在不同器官中表達半定量結果

4 結語

本研究通過實時熒光定量PCR和半定量RT-PCR對揚麥158的根、幼葉、葉鞘、成熟葉、小穗和籽粒等組織中Sec24a、Sec24b和Sec24c三個基因亞型進行初步的表達差異分析，結果顯示這三個基因亞型均不是組織特異性表達的基因，它們能在不同的組織中表達，但表達量之間存在很明顯的差異。Sec24基因的三個基因亞型具體行使哪些功能，Sec24a基因亞型怎樣調控胚乳蛋白體發育和貯藏蛋白積累，都還需要進一步的實驗驗證。這些問題的解決或許將有助于深化谷物胚乳貯藏蛋白積累和蛋白體發育機制的研究，而且對我國優質專用小麥品種的選育和加工品質的改良具有重要的科學意義和現實意義。

圖中A花后8 d小麥穎果；B花后18 d小麥穎果；C花后28 d小麥穎果；D旗葉；E莖；F幼穗；G根；不同小寫字母間的數據存在顯著性差異(p<0.05)

圖2小麥Sec24基因的三個亞型Sec24a、Sec24b、Sec24c在不同器官中相對表達量