高效液相色譜-紫外檢測豆制品中堿性橙Ⅱ的含量

劉擁亮,李紅梅

(高郵市產品質量綜合檢驗檢測中心，江蘇 高郵 200031)

1 引言

堿性橙Ⅱ(BasicOrangeⅡ)又被稱為“塊黃”是一種偶氮類堿性工業用的染料，將其加入制品中使其成為顏色漂亮而不易退色的亮黃色，在日常生活中主要用在一些紡織用品、皮革方面制品及木制家具等的亮黃色染色[1～5]。GB2760-2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》[6]在豆制品中堿性橙Ⅱ不得使用。堿性橙Ⅱ對人身體有致癌作用，本文研究了液相色譜紫外檢測外標法定量豆制品中堿性橙Ⅱ的方法，此方法檢出限低重復性好，能夠作為日常豆制品中堿性橙Ⅱ含量的測定依據。

2 實驗部分

2.1 材料、試劑和儀器

堿性橙Ⅱ標準品(農業部環境保護科研檢測所)；豆制品(蘭庭農貿購買)；甲醇(色譜純)(上海安譜實驗科技股份有限公司)；乙酸銨(分析純)，實驗室一級水(實驗室純水機自制)； 美國Waters e2695液相色譜配有W2487紫外檢測器(美國Waters公司)。

2.2 實驗方法

2.2.1 液相色譜(LC)條件選擇

Waters公司產C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；甲醇(A相): 0.02 mol/L乙酸銨溶液(B相)體積比65∶35作為本次實驗的流動相；樣品進樣量10 μL；液相色譜的流速1.0 mL/min；堿性橙Ⅱ最大吸收波長為449 nm，采用最大吸收波張保留時間定性液相色譜-紫外檢測分析。

2.2.2 標準溶液配制

準確稱取堿性橙Ⅱ標準品0.01 g，用甲醇溶解后定容至10 mL容量瓶中，搖勻，該溶液作為標準儲備溶液。準確移取上述溶液并且用甲醇稀釋定容為5、10、25、50、100 μg/mL標準系列溶液。

2.2.3 樣品制備

稱取粉碎后20 g豆腐干試樣放入50 mL具塞離心管中，在離心管中加5 g無水硫酸鈉和25 mL無水乙醇超聲提取30 min，然后放入冷凍離心機離心，取離心管中上層提取液置于另外一只50 mL離心管中，在原先的離心管中再次加入10 mL無水乙醇，重復提取3次后合并上層提取液到離心管中， 將合并后的提取液減壓濃縮近干，用乙腈溶解，加入正已烷10 mL漩渦振蕩萃取10 min，棄去正已烷層，重復3次，將乙腈層減壓濃縮至近干，用無水乙醇溶解，氮氣吹干，用甲醇液定容至1 mL，過膜，進行HPLC分析。

3 結果與討論

3.1 流動相選擇

采取甲醇和乙酸銨20∶80，甲醇和乙酸銨40∶60，甲醇和乙酸銨65∶35三個梯度，甲醇比例在20%的時候分離度不太好，隨著甲醇比例增大，一直到65%的時候分離度最好，所以就選擇甲醇和乙酸銨=65∶35作為此次實驗的流動相。

3.2 線性范圍、回歸方程及檢出限

吸取堿性橙Ⅱ標準溶液按照2.2.1條件進行檢測，以儀器響應值對應的色譜峰面積為縱坐標，以堿性橙Ⅱ標準溶液的濃度(g/mL)為橫坐標，繪制標準曲線進行回歸分析，結果表明：y=7.18e+004x-3.06e+004，R2=0.99986。堿性橙Ⅱ在5～100 μg/mL之間線性關系良好。并以信噪比等于3為標準，測得堿性橙Ⅱ的檢出限為0.01 μg/mL(圖1)。

3.3 重復性實驗

取在豆腐干檢測中堿性橙Ⅱ檢出的陽性樣品，重復測定6次，記錄色譜圖，相對標準偏差為5.63%，說明用本方法測豆腐干中堿性橙Ⅱ含量精密度和重復性良好(表1)。

圖1 標準曲線

表1 重復性實驗

3.4 加標回收率及精密度實驗

選擇中(0.5 mg和1.0 mg)、高(5.0 mg)和低(0.05 mg)四個濃度作為加標量，在每個濃度選擇測定6個樣品，按照2.2.3前處理方法處理樣品，處理好的樣品進液相色譜紫外檢測性定量分析。結果見表2，加標回收率96.0%～99.8%之間，標準偏差在0.45%～5.01%之間，方法精密度能夠達到實驗要求。

3.5 樣品測定

樣品的測定：市場上購買的豆腐干樣品10份，按2.2.3方法制備樣品溶液，液相色譜紫外檢測器檢測，計算含量，有2份樣品檢出堿性橙Ⅱ，含量在1.1 μg/mL左右，其余8份樣品沒有檢測出來，顯示陰性結果。堿性橙Ⅱ標準品和樣品色譜圖見圖2和圖3，堿性橙Ⅱ標準品出峰時間在4.9 min左右。

表2 回收率實驗

圖2 堿性橙Ⅱ標準譜圖

圖3 樣品譜圖

4 結論

本文采用高效液相色譜-紫外檢測豆制品中非法添加物質堿性橙Ⅱ中含量，結果表明：采用紫外檢測器檢測，檢測波長為449 nm，液相色譜分析條件：采用C18柱，流動相甲醇(A相):乙酸銨(0.02 mol/L)(B相)體積比65∶35，本方法線性范圍5～100 μg/mL，最

低檢出限為0.01 μg/mL，中(0.5 mg和1.0 mg)、高(5.0 mg)和低(0.05 mg)4個濃度的加標回收率在96.0%～99.8%。該方法適用于日常檢測豆制品中堿性橙Ⅱ定量分析。