芪芩湯對新型呼腸孤病毒試驗感染雛鴨治療效果分析

劉 佳 ,楊 穎 ,朱兆榮,2 ,劉 娟,2

(1.西南大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院中藥創(chuàng)新實驗室,重慶榮昌402460 ;2.重慶市高校獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心中獸藥創(chuàng)新實驗室,重慶榮昌 402460)

1 材料與方法

1.1 試驗雛鴨 7 日齡健康雛鴨75 只和9 日齡健康雛鴨5 只,購自榮昌縣唐沖健康種鴨專業(yè)合作社,未免疫任何疫苗。自由飲水采食,隔離飼養(yǎng);9 日齡鴨胚購自重慶市永健生物技術(shù)有限公司供貨鴨場;病死雛鴨,來源于臨床診斷病例。

1.2 藥物與試劑 黃芪、黃芩、板藍(lán)根、金銀花、連翹購自重慶市迪盛醫(yī)藥有限公司;鴨α 干擾素酶聯(lián)免疫試劑盒(20161201)、鴨β 干擾素酶聯(lián)免疫試劑盒(20161201)、鴨γ 干擾素酶聯(lián)免疫試劑盒(20161201)購自上海瑤韻生物科技有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備 立式壓力滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);SW-CJ-1FD 潔凈工作臺(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);Model 680 酶標(biāo)儀(BiO-Rad Laboratories,USA)。

1.4 芪芩湯的組成和制備 將黃芪、黃芩、板藍(lán)根、金銀花、連翹以2∶3∶2∶3∶2比例依次倍比組方,清水浸泡30 min 后熬制40 min,收集濾液,重復(fù)3 次,合并藥液過濾,分別減壓濃縮至2 g/mL、1 g/mL、0.5 g/mL 湯劑,-20 ℃保存?zhèn)溆?飼喂前溫化處理。

1.5 試驗方法

1.5.1 病料采集與病毒處理 采集臨床病死雛鴨的肝臟、脾臟,制成勻漿,反復(fù)凍融3 次,3 800 r/min離心10 min,經(jīng)孔徑為220 nm 濾膜過濾的病毒液凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 鴨胚半數(shù)感染量(ELD50)測定及尿囊液收集 將病毒液5 000 r/min 離心5 min 后,取上清用無菌的生理鹽水作10 倍系列稀釋,試驗采用4 個稀釋梯度,即:10-5、10-6、10-7、10-8。選用20 枚健康9 日齡鴨胚進(jìn)行ELD50測定,每個稀釋度經(jīng)尿囊腔接種5 枚鴨胚,0.1 mL/枚,觀察并記錄72 h 內(nèi)鴨胚的死亡數(shù),并無菌采集120 h內(nèi)死亡的鴨胚的尿囊液,按Reed-Muench 計算ELD50。

1.5.3 分組與處理 75 只7 日齡雛鴨隨機(jī)分成為空白組、模型組、芪芩湯高劑量組、芪芩湯中劑量組和芪芩湯低劑量組,每組15 只。空白組雛鴨皮下注射0.1 mL/只滅菌生理鹽水,除空白組外每只雛鴨皮下注射0.1 mL 尿囊液,同時3 個芪芩湯劑量組分別灌喂劑量為2g/mL、1 g/mL、0.5 g/mL 濃縮藥各1 mL,早晚各1 次,用藥7 d,分室隔離飼養(yǎng)。

該區(qū)普查工作尚未結(jié)束，為了配合下一步普查勘查工作，本文試圖通過近年來該礦床的勘查及科研成果資料，系統(tǒng)的闡述礦區(qū)內(nèi)地層、構(gòu)造、巖漿巖、圍巖蝕變及礦體地質(zhì)特征,結(jié)合典型礦脈（體）的解剖, 總結(jié)區(qū)內(nèi)找礦標(biāo)志，對下一步普查勘查及幕阜山巖體西南緣稀有金屬優(yōu)選靶區(qū)有著指導(dǎo)作用。

1.5.4 臨床癥狀及病變觀察 試驗期間每日進(jìn)行臨床觀察,記錄臨床癥狀,統(tǒng)計并比較各組發(fā)病情況,并對發(fā)病死亡的雛鴨剖檢,觀察并記錄各組肝和脾臟等器官的肉眼變化。

1.5.5 病理組織學(xué)觀察 將采集的部分組織樣品置于10%中性福爾馬林緩沖液中固定,常規(guī)方法制備石蠟切片,H.E.染色后觀察其組織病理學(xué)變化。

1.5.6 樣品的采集及檢測 分別于注射NDRV 并用藥后第1、4、8 天各組采集10 只雛鴨靜脈血,分離血清,ELISA 測定IFN-α、IFN-β 及IFN-γ 含量。

1.5.7 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)用SPSS2.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析,用LSD 多重比較法對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗,顯著性水平設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 病毒的鴨胚半數(shù)致死量(ELD50) 由表1 可知,按Reed-Muench 法計算得出ELD50=10-6.84/0.1 mL。

表1 9 日齡鴨胚ELD50測定(接種劑量0.1 mL/只)

2.2 芪芩湯對NDRV 病雛鴨存活率的統(tǒng)計 從表2 可知,空白組雛鴨全部存活。與空白組相比,模型組雛鴨存活率(40%)降低,差異極顯著(P<0.01)。與模型組相比,芪芩湯高劑量組、中劑量組、低劑量組雛鴨存活率升高,差異顯著(P<0.05)。

表2 各試驗組雛鴨存活率

2.3 雛鴨的臨床癥狀及剖檢變化 結(jié)果顯示,空白組雛鴨在整個試驗觀察期均無異常反應(yīng),剖檢未見肉眼可見的病變;模型組雛鴨表現(xiàn)為精神沉郁,食欲減少或廢絕,不愿走動,擁擠成堆,拉黃白色或綠色帶有黏液的稀糞,肛門周圍有大量稀糞粘著,泄殖腔擴(kuò)張、外翻,部分鴨趾關(guān)節(jié)或跗關(guān)節(jié)腫脹,腳軟,有腹腔漿膜炎癥狀。剖檢變化為:發(fā)病初期,模型組雛鴨脾臟腫大出血,呈圓形或不規(guī)則分布,質(zhì)脆(見中插彩版圖1-A),發(fā)病后期鴨脾臟腫大,嚴(yán)重壞死(見中插彩版圖1-B),可見黃白色壞死灶并有黃色假膜(見中插彩版圖1-C)。肝臟腫脹出血,表面分布有白色壞死點(見中插彩版圖1-D)。芪芩湯

高、中、低劑量組未見明顯的異常表現(xiàn),剖檢未見肉眼可見的病變。

圖1 感染NDRV 雛鴨剖檢的病理變化

圖2 模型組、空白組和用藥組雛鴨脾臟病理組織學(xué)變化

2.4 雛鴨的組織病理學(xué)觀察 結(jié)果顯示,空白組雛鴨脾臟組織結(jié)構(gòu)正常,未見異常組織病理變化(見中插彩版圖2-B)。雛鴨感染NDRV 后,病理組織學(xué)變化以脾臟為主,可觀察到脾臟壞死灶可見有炎性細(xì)胞、多核巨細(xì)胞浸潤形成肉芽腫(見中插彩版圖2-A)。芪芩湯高、中、低劑量組雛鴨脾臟切片均未出現(xiàn)如模型組一般的病變組織肉芽腫結(jié)構(gòu)(見中插彩版圖2-C)。

2.5 芪芩湯對NDRV 病雛鴨血清中IFN-α、IFNβ、IFN-γ 的影響 由表3 可知,與空白組相比,試驗第4、8 天,模型組雛鴨血清中IFN-α 含量降低,其中在第4 天差異顯著(P<0.05),在第8 天差異極顯著(P<0.01)。與模型組相比,試驗第8 天,芪芩湯高劑量組雛鴨血清IFN-α 含量升高,差異極顯著(P<0.01);試驗第4、8 天,芪芩湯中劑量組和低劑量組雛鴨血清IFN-α 含量升高,差異極顯著(P<0.01)。

由表4 可知,與空白組相比,試驗第1、4 天,模型組雛鴨血清中IFN-β 含量有升高的趨勢,試驗第8 天IFN-β 含量有降低的趨勢,但差異不顯著(P>0.05)。與模型組相比,試驗第4、8 天,芪芩湯高、中劑量組雛鴨血清中IFN-β 含量升高,差異極顯著(P<0.01);試驗第4、8 天,芪芩湯低劑量組雛鴨血清中IFN-β 含量升高,其中在第4 天差異顯著(P<0.05),在第8 天差異極顯著(P<0.01)。

由表5 可知,與空白組相比,試驗第1、4、8 天,模型組雛鴨血清中IFN-γ 含量降低,其中在第1 天差異顯著(P< 0.05),在第4、8 天差異極顯著(P<0.01)。與模型組相比,芪芩湯高、中劑量組雛鴨血清中IFN-γ 在第4、8 天含量升高,差異極顯著(P<0.01);芪芩湯低劑量組雛鴨血清中IFN-γ 含量在試驗第1、4、8 天有升高的趨勢,但差異不顯著(P>0.05)。

表3 NDRV 病雛鴨血清中IFN-α 含量的變化(,ng/L,n=10)

表3 NDRV 病雛鴨血清中IFN-α 含量的變化(,ng/L,n=10)

表4 NDRV 病雛鴨血清中IFN-β 含量的變化(,ng/L,n=10)

表4 NDRV 病雛鴨血清中IFN-β 含量的變化(,ng/L,n=10)

表5 NDRV 病雛鴨血清中IFN-γ 含量的變化(,ng/L,n=10)

表5 NDRV 病雛鴨血清中IFN-γ 含量的變化(,ng/L,n=10)

3 討論

脾臟是機(jī)體內(nèi)最大的外周免疫器官,脾臟一旦損傷,必然會導(dǎo)致免疫細(xì)胞發(fā)育和功能出現(xiàn)障礙,影響脾臟的免疫功能[12],而病理剖檢和病理組織切片能客觀、快速的顯示組織損傷或修復(fù)情況[13]。本試驗結(jié)果顯示,受NDRV 感染雛鴨脾臟腫脹,表面有出血和壞死,組織病理學(xué)觀察到脾臟壞死區(qū)出現(xiàn)“肉芽腫”結(jié)構(gòu),與文獻(xiàn)[14]結(jié)果一致。給予芪芩湯治療后,雛鴨脾臟組織未出現(xiàn)明顯異常的組織病理學(xué)變化,說明芪芩湯能夠抑制NDRV 對免疫器官的損傷,具有保護(hù)雛鴨抗感染的作用。

新型呼腸孤病毒辯證屬瘟熱毒邪入侵、由表及里,內(nèi)侵于脾胃肝膽,宜清熱解毒、保肝利膽、扶正祛邪。故選用黃芪、黃芩、板藍(lán)根、金銀花、連翹等組成的中藥復(fù)方制劑芪芩湯,具有清熱解毒、利水消腫之功效。方中黃芪補(bǔ)氣升陽、利水消腫治其本,黃芩清熱燥濕、瀉火解毒,板藍(lán)根清熱解毒、利咽消腫,諸藥合用共奏扶正祛邪之功效。存活率是反映試驗藥物對靶動物是否真實可靠最直接的指標(biāo)[15]。本試驗結(jié)果顯示,感染NDRV 雛鴨的存活率為40%,芪芩湯高劑量組、中劑量組、低劑量組雛鴨存活率分別為86.87%、80%、66.67%,說明芪芩湯可提高雛鴨的存活數(shù),對新型呼腸孤病毒具有一定的治療作用。

NDRV 進(jìn)入機(jī)體后能快速誘導(dǎo)宿主中干擾素的產(chǎn)生[16]。干擾素分為I 型和II 型兩類,I 型干擾素主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)抗病毒蛋白來發(fā)揮作用,II型干擾素抗病毒功能稍弱,但其免疫調(diào)節(jié)功能較強(qiáng)[17]。IFN-β 和IFN-α 在先天免疫中發(fā)揮著重要的作用,IFN-α 主要是通過控制病毒基因組轉(zhuǎn)錄、切割病毒RNA 以及阻止翻譯來抑制病毒的感染[18]。此外,IFN-α 可以刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答間接發(fā)揮抗病毒作用[19]。本試驗結(jié)果顯示,試驗第4、8 天時,模型組雛鴨血清中IFN-α 含量顯著降低,推測病毒入侵機(jī)體后會抑制雛鴨機(jī)體內(nèi)IFN-α 的產(chǎn)生,從而阻斷IFN-α 抗病毒效應(yīng)。給予芪芩湯治療后,雛鴨血清中IFN-α 含量顯著升高,推測芪芩湯能夠提高雛鴨血清中IFN-α 的含量來參與先天性抗病毒反應(yīng)。IFN-β 由成纖維細(xì)胞和病毒核酸等物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生,具有廣譜的抗病毒作用[10]。在病毒感染起始階段,它會通過自分泌和旁分泌兩種方式起作用,來防止病毒的復(fù)制與傳播[20]。本試驗結(jié)果顯示,試驗第1、4 天雛鴨血清中IFN-β 呈現(xiàn)升高的趨勢,到試驗第8 天雛鴨血清中IFN-β 呈現(xiàn)降低的趨勢,結(jié)果表明,NDRV 在組織細(xì)胞內(nèi)大量增殖,雛鴨的免疫功能受到一定的損害。而經(jīng)芪芩湯治療后,3 個劑量組雛鴨血清中IFN-β 含量顯著升高,提示芪芩湯促進(jìn)雛鴨機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生IFN-β,調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答清除體內(nèi)病毒,使病毒數(shù)量先升高后降低,抑制病毒的復(fù)制與傳播,從而降低對雛鴨免疫器官的損害。

IFN-γ 能干擾大多數(shù)病毒的產(chǎn)生,在刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎性因子和激活NK 細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)起著重要的作用[21]。初次感染NDRV 病毒時,感染的細(xì)胞會產(chǎn)生IFN-γ,雖然不能直接抑制細(xì)胞中病毒的復(fù)制,但I(xiàn)FN-γ 能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白,從而阻止病毒在細(xì)胞內(nèi)繁殖[22],而機(jī)體內(nèi)的IFN-γ 減少會使上述過程受阻,NDRV 病毒大量擴(kuò)散。本試驗結(jié)果顯示,NDRV 感染后雛鴨血清中IFN-γ 含量顯著降低,提示NDRV 破壞了雛鴨的免疫系統(tǒng),而芪芩湯治療可以顯著提高NDRV 雛鴨血清中IFN-γ 的含量,說明芪芩湯對IFN-γ 有顯著的調(diào)節(jié)作用,恢復(fù)或增強(qiáng)病鴨的免疫應(yīng)答,從而發(fā)揮保護(hù)機(jī)體的作用。

綜上所述,芪芩湯能夠減輕感染雛鴨的臨床癥狀與病理變化,調(diào)控NDRV 感染的雛鴨體內(nèi)IFN-α、IFN-β、IFN-γ 的分泌從而達(dá)到防治NDRV 的作用,但其如何調(diào)控機(jī)體內(nèi)干擾素的變化,還待進(jìn)一步的研究。