Au@Ag NPs表面增強拉曼快速測定奶粉中的三聚氰胺

王海波，覃文霞，余婉松，袁光蔚，鄭娟梅

（1.廣西-東盟食品藥品安全檢驗檢測中心，廣西 南寧 530021；2.賽默飛世爾科技（中國）有限公司，上海 201206）

三聚氰胺的單分子含氮量較高，它不能在體內代謝，過多的攝入會嚴重危害人體健康。我國衛生部等相關部門規定[1]：嬰兒配方食品中三聚氰胺的限量值為1 mg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg。因此快速有效地檢測奶制品中的三聚氰胺是食品安全領域的迫切需求。目前，用于三聚氰胺的檢測方法主要有氣相色譜-質譜聯用法[2]、液相色譜-質譜聯用法[3-4]、高效液相色譜法[5-6]等。但上述種方法的樣品前處理步驟繁瑣、耗時長、技術成本高，不利于快速檢測。

拉曼光譜（Raman spectroscopy）是一種能夠表征分子振動能級的光譜，具有極高的分子特異性，但其散射強度較弱且易受到熒光干擾[7]。1974年Fleischmann等[8]在粗糙銀電極表面獲得吡啶的增強拉曼散射信號，這種表面增強效應與金屬粗糙表面相關，該效應被稱為表面增強拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）效應。SERS 技術快速、靈敏、無損，具備分子指紋專一性和單分子靈敏性的特點，能在分子水平上提供物質結構的豐富信息，已逐漸成為化學、生物、環境、食品等領域一種強有力的檢測手段[9-12]。在食品檢測領域，SERS 方法檢測三聚氰胺引起了人們廣泛的研究興趣。湯俊琪等[12]采用堿性銀膠表面增強拉曼光譜技術分析了牛奶中的三聚氰胺，該試驗未對牛奶進行預處理，蛋白質含量高的奶制品基質會影響分析物與基底之間的吸附，拉曼增強效果不明顯；且銀膠易被氧化，穩定性及均一性不強。

因此本試驗使用乙腈提取奶粉中的三聚氰胺，以去除基質干擾，將均一性及穩定性較強的Au@Ag NPs作為增強基底，對三聚氰胺進行SERS 檢測。本方法能有效降低基質對待測分析物的干擾，使得待測分析物與增強基底更好的結合，進而提高三聚氰胺的檢測靈敏度。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

便攜式拉曼光譜儀（FoodDefender RM）：Thermo Fisher Scientific 公司；超純水儀（型號 A10）：Milli-Q 公司；高速離心機（型號 A-14C）：Sartorius 公司；磁力攪拌儀（型號C-MAG HS7）：IKA 公司；超聲儀（型號S300H）：Elmasonic 公司；紫外-可見分光光度計（型號UV2700）：島津公司。

1.2 試劑配制

5.0 mol/L NaCl 的制備：準確稱取 29.22 g 的 NaCl，用超純水定容至100 mL。必要時可稀釋到1.0 mol/L。

5.0 mol/L NaOH 的制備：準確稱取20.00 g 的NaOH，用超純水溶解后轉移定容至100 mL。必要時可稀釋到1.0 mol/L。

金溶膠 Au NPs（Nanoparticles 納米顆粒）的制備[13]：精確稱取0.050 g 氯金酸于500 mL 容量瓶，用超純水溶解并定容，得到0.1 g/L 的氯金酸溶液。精確稱取1.000 g 檸檬酸三鈉于100 mL 容量瓶，用超純水定容，得到10 g/L 的檸檬酸三鈉溶液。準確量取100 mL 氯金酸溶液于三口燒瓶，在磁力攪拌速率為1 100 r/min 的條件下油浴加熱至沸騰（約150 ℃），迅速速加入1 mL 上述檸檬酸三鈉溶液，繼續加熱至顏色呈酒紅色后持續加熱15 min，即得到酒紅色的金溶膠溶液，冷卻后倒入棕色瓶中，4 ℃避光保存。

銀溶膠 Ag NPs 的制備[14]：稱取 45.00 mg AgNO3于圓底燒瓶中，加入250 mL 超純水溶解，安裝好冷凝回流裝置，加熱至沸，立刻加入5 mL 質量濃度為10 g/L檸檬酸三鈉水溶液，繼續加熱1 h 后停止，顏色依次呈現淡黃、深黃、黃綠、灰色。冷卻至室溫（25 ℃）后于冰箱內4 ℃避光保存。

銀包金溶膠 Au@Ag NPs 的制備[15]：取 50 mL 的 2×10-4moL/L 氯金酸水溶液于圓底燒瓶，油浴加熱至沸，磁力攪拌下迅速加入0.74 mL 的10 g/L 檸檬酸三鈉溶液，繼續加熱5 min，至液體呈紅色不變色，冷卻至室溫（25 ℃）。取3 mL 上述紅色液體于10 mL 容量瓶中，加入400 μL 0.1 mol/L 抗壞血酸，并用磁力攪拌器攪拌，邊攪拌邊逐滴加入1 mmol/L AgNO3溶液（每次添加10 μL，每隔 30 s 加一次），共加入 AgNO3溶液 0.9 mL，所得Au@Ag NPs 于冰箱內4 ℃避光保存。

1.3 樣品檢測方法

樣品處理方法：取0.500 g 奶粉于試管中，加入3 mL乙腈，超聲2 min，靜置20 s，用吸管吸取上清液至離心管，以10 000 r/min 離心5 min。取2 mL 上清液于試管中，加入凝聚劑（1 mL 的 5 mol/L NaCl 和 1 mL 的 1 mol/L NaOH），振蕩20 s 靜置分層，取1 mL 下層溶液至1.5 mL 離心管，以 10 000 r/min 離心 5 min，取上清液50 μL 于拉曼樣品池，加入 200 μL 水，混勻后加 50 μL增強基底Au@Ag NPs，混勻4 min 后置于便攜式拉曼光譜儀中測定。

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測定條件：激光光源波長785 nm，激光光源功率為250 mW，光譜采集范圍250 cm-1～2 875 cm-1。為了保證自制銀包金溶膠Au@Ag NPs 增強信號的重現性，得到的數據具有說服力，每個樣品需重復3 次試驗，每次試驗需采集5 條光譜計算其平均值。

2 結果與分析

2.1 三聚氰胺標準溶液的拉曼光譜圖及峰歸屬

三聚氰胺的常規拉曼光譜圖如圖1所示。

圖1 三聚氰胺的SERS 信號圖Fig.1 SERS signal diagram of melamine

在704、1 072 cm-1附近的特征峰在圖譜中清晰可見。其中704 cm-1為環呼吸振動峰，1 072 cm-1為C-NC 鍵彎曲振動峰[16]。上述譜峰均可作為定性鑒別三聚氰胺分子的特征譜峰。

2.2 凝聚劑的考察

8 份3 mg/kg 的加標奶粉使用不同的凝聚劑按1.3試驗方法進行測定，得到結果見圖2。

圖2 不同凝聚劑對SERS 信號的影響Fig.2 Effect of different coagulants on SERS signal

僅使用NaOH 作為凝聚劑時，特征峰信號強，但基線噪音波動大；僅使用NaCl 作為凝聚劑時，無拉曼信號出現。這說明NaOH 可使拉曼信號增強，而NaCl 可平滑基線噪音，故使用NaCl 與NaOH 的混合溶液作為凝聚劑。使用1 mol/L NaCl+1 mol/L NaOH 作為凝聚劑時，各特征峰信號均很弱；使用1 mol/L NaCl+5 mol/L NaOH 作為凝聚劑時，1 072 cm-1處的特征峰信號較弱。使用5 mol/L NaCl+1 mol/L NaOH 或者5 mol/L NaCl+5 mol/L NaOH 作為凝聚劑時，各特征峰信號清晰可見，且基線平穩，這是因為該溶液能有效的控制金屬納米顆粒的表面化學，如pH 值、離子強度、結構等，使得分析物與金屬納米顆粒良好接觸，等離子體共振被激發，從而得到較好的拉曼增強效果[17]。選擇使用5 mol/L NaCl+1 mol/L NaOH 作為凝聚劑。

2.3 三聚氰胺與增強基底的反應時間考察

將3 mg/kg 的加標奶粉按1.3 試驗方法分別在0、1、2、3、4、5、6 min 進行測定，得到結果見圖 3。

圖3 反應時間對SERS 信號的影響Fig.3 Influence of reaction time on SERS signal

加入增強基底Au@Ag NPs 后，三聚氰胺需要一定的時間與其反應，4 min 即完成反應，4 min 后所測得的拉曼光譜信號無明顯差異，可見Au@Ag NPs 與三聚氰胺反應迅速，且兩者結合穩定。4 min 后即可測定。

2.4 比較Au@Ag、Au和Ag NPs基底活性

2.4.1 3 種納米粒子的紫外可見吸收光譜（ultravioletvisible absorption spectrum）表征

將 1.2所制備的 3 種納米粒子 Au@Ag NPs、Ag NPs、Au NPs 分別置于紫外-可見分光光度計測定，得到結果見圖4。

圖4 Au@Ag、Au 和 Ag NPs 的 UV-vis 光譜Fig.4 UV-vis spectra and sol color of Au@Ag，Au and Ag NPs

1 mmol/L AgNO3加入量為 0.9 mL 的 Au@Ag NPs顯明亮的黃色，不同于灰色的Ag NPs 和紅色的Au NPs。此時的Au@Ag NPs 的最大吸收峰位與Ag NPs 接近。比較Au@Ag NPs 和Ag NPs 的UV-Vis 光譜可觀察到，Ag 譜線吸收峰略不對稱且相應的半峰寬比Au@Ag NPs 寬，說明Au@Ag NPs 比純Ag NPs 的顆粒更均勻，分散性更好。Ag 殼共振變強Au 核共振弱，結果Au@Ag NPs 共振范圍從320 nm 到550 nm，共振峰寬且強，這使得它比純金屬Au 和Ag NPs 有略強的增強效果。

2.4.2 3 種納米粒子的三聚氰胺SERS 比較

3 份3 mg/kg 的加標奶粉分別使用金溶膠Au NPs、銀溶膠Ag NPs、銀包金溶膠Au@Ag NPs 作為增強基底，按1.3 試驗方法進行測定，結果見圖5。

圖5 3 種納米粒子的三聚氰胺SERS 信號Fig.5 Melamine SERS signal of three kinds of nanoparticles

使用金溶膠Au NPs 做為增強基底時，熒光很強，無拉曼信號；而使用銀溶膠Ag NPs 或銀包金溶膠Au@Ag NPs 作為增強基底時，各個特征峰響應信號較強，能得到很好的拉曼圖譜。說明金納米顆粒對三聚氰胺無SERS 增強效應，銀納米顆粒能有效的增強三聚氰胺的SERS 信號。而Au@Ag NPs 溶膠表面為銀納米顆粒，即能增強三聚氰胺的SERS 信號，又具有金溶膠良好的均勻性、分散性和穩定性[15]，故選擇Au@Ag NPs溶膠作為增強基底。

2.5 三聚氰胺標準溶液與基質加標的擬合曲線對比

分別取 0.5 mL 的 0.3、0.5、1、2、3、5 μg/mL 三聚氰胺標準溶液于試管中，按1.3 的檢測方法進行測定，所得拉曼光譜圖見圖6。

圖6 三聚氰胺標準溶液的SERS 信號Fig.6 SERS signal of melamine standard solution

圖中均有明顯的特征峰，且基線平穩。選擇704cm-1處特征峰進行定量，將其換算為1 000 cm-1曝光的峰高強度，并與標準溶液的濃度做歸一化線性擬合處理，所得標曲見圖7，三聚氰胺在該濃度范圍內有良好的線性關系。

圖7 三聚氰胺標準溶液的擬合曲線Fig.7 Fitting curve of melamine standard solution

稱取0.5 g 奶粉6 份，分別加入一定量的三聚氰胺標準溶液，得到濃度為 0.3、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mg/kg的加標樣，按1.3 的檢測方法進行測定，所得拉曼光譜圖見圖8，同理繪制擬合曲線見圖9。

圖8 基質加標三聚氰胺的SERS 信號Fig.8 SERS signal of matrix addition melamine

圖9 基質加標三聚氰胺的擬合曲線Fig.9 Fitting curve of matrix addition melamine

三聚氰胺在該基質加標濃度范圍內有良好的線性關系，滿足定量測定要求。

2.6 檢出限的確定

將三聚氰胺含量為0.3 mg/kg 的加標奶粉按1.3操作并測定10 次，選擇704 cm-1處特征峰讀出信噪比，用3 倍信噪比求得檢出限為0.008 5 mg/kg。該值遠低于GB/T 22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》[18]方法一的定量限2 mg/kg。

2.7 樣品測定及加標回收試驗

將隨機購買的2 批實際樣品分別按1.3 操作，為了減小基質干擾，采用基質加標曲線計算其濃度，2 批樣品均未檢出三聚氰胺。2 批實際樣品均做加標回收試驗，每個加標水平分別取6 份平行樣，加標后濃度分別為 1、3、5 mg/kg，所得 SERS 信號圖見圖10、11，結果如表1所示。回收率在71.07%～91.15%之間，相對標準偏差（n=6）在1.52%～4.22%之間，該方法有較高的準確度和重現性，適用于奶粉中的三聚氰胺檢測。

圖10 樣品1 各濃度加標試驗的平均拉曼光譜圖Fig.10 Average SERS signal of different concentrations plus standard sample1

圖11 樣品2 各濃度加標試驗的平均拉曼光譜圖Fig.11 Average SERS signal of different concentrations plus standard sample2

3 結論與討論

本研究建立表面增強拉曼光譜快速測定奶粉中三聚氰胺的方法。用乙腈提取奶粉中的三聚氰胺，去除基質對拉曼檢測的影響；制備三種納米粒子并用UV-Vis 對其進行表征，得知Ag@Au NPs 有較好均勻性、分散性及拉曼增強效果；比較3 種納米粒子對三聚氰胺的拉曼增強效果再次驗證Ag@Au NPs 的SERS 增強效果較好；優化凝聚劑、反應時間等拉曼增強條件，以獲得最佳的SERS 信號。本方法檢出限為0.008 5 mg/kg，回收率在71.07%～91.15%，RSD 相對標準偏差（n=6）在1.52%～4.22%，準確度及精密度好，靈敏度高，操作簡單，10 min 內能完成檢測，可實現快速測定奶粉中三聚氰胺，有望應用于其他復雜基質食品的分析測定。

表1 樣品的測定結果及加標回收實驗結果Table 1 Determination results of sample and results of recovery experiments