高效液相色譜法測定獼猴桃酒中4 種有機酸含量

倪慧，李華佳，李可，尚雪嬌，朱永清，郭壯，*

（1.湖北文理學院食品科學技術學院鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.四川省農業科學院農產品加工研究所，四川 成都 610066）

獼猴桃又稱奇異果，因其口感酸甜，富含豐富的VE、VC、膳食纖維、黃酮和多酚等營養成分[1-2]，且具有降血脂[3]和抗氧化[4]功能而深受消費者的喜愛。獼猴桃屬于呼吸躍變型水果，采摘后容易軟化和腐敗變質[5]，因而對獼猴桃進行深加工則顯得尤為重要。發酵制作獼猴桃酒不僅可以提高獼猴桃的利用率[6-7]，而且能更好發揮其特有的保健功效[8]，同時提高農產品附加值。作為影響獼猴桃酒風味形成的重要影響因素之一[9]，通過測定有機酸種類和含量可間接對獼猴桃酒品質的優劣進行評價。

目前常采用酸堿滴定法[10]、離子色譜法[11]、紅外光譜法[12]和色譜法[13]對食品中有機酸的種類和含量進行測定。GB5009.157-2016《食品安全國家標準食品中有機酸的測定》中約束了使用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC） 測定食品中的有機酸，相較于其他方法，該方法具有準確、方便和快捷等優點。雖然可以參照GB2758-2012《食品安全國家標準發酵酒及其配制酒》采用HPLC 法測定獼猴桃酒中的有機酸，但上述標準對獼猴桃和獼猴桃酒中的特征酸——奎寧酸[14]的檢測方法并未加以描述，因此對獼猴桃酒中有機酸的測定方法進行優化則顯得尤為重要。

本試驗采用HPLC 對獼猴桃酒中奎寧酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸的測定方法進行了優化，并對10 個自釀獼猴桃酒中4 種有機酸的含量進行了測定。通過本項目的開展，實現了獼猴桃酒中4 種有機酸的快速檢測和定量分析，以期為后續獼猴桃酒的生產工藝改良和相關標準的制定提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Lactobacillus plantarum（植物乳桿菌）：由湖北文理學院鄂西北傳統發酵食品菌種資源庫提供；獼猴桃酒：湖北文理學院鄂西北傳統發酵食品研究所自釀；奎寧酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸：均為標準品，默克生命科學（上海）有限公司；磷酸氫二銨、磷酸二氫鉀、磷酸：均為分析純，西隴科學股份有限公司；甲醇、乙腈、異丙醇：均為色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；偏重亞硫酸鉀、果膠酶（5 萬U/g）：均為食品級，煙臺帝伯仕自釀機有限公司；0.22 μm 一次性針頭式過濾器和合成纖維樹脂濾膜：上海市新亞凈化器件廠。

LC-20ADXR 高效液相色譜儀（配置有LC-20AD XR 四元低壓梯度泵、SIL-20A XR 自動進樣器、CTO-10AS vp 柱溫箱和SPD-M20A 二極管陣列檢測器）、InertSustainSwift C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：日本島津公司；5810R 臺式高速冷凍離心機：德國Ep－pendorf 公司；PHS-25 型pH 計：上海儀電科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件的優化

1.2.1.1 有機酸標準溶液配制

準確稱取0.600 0 g 奎寧酸、0.600 0 g 蘋果酸、3.000 0 g 乳酸和1.200 0 g 檸檬酸標準品，溶解后于50 mL 容量瓶中定容，配制成不同濃度的有機酸母液待用。

1.2.1.2 供試溶液的配制

吸取各有機酸母液0.50 mL 于10 mL 容量瓶中，加入0.20 mL 的0.10 mol/L 磷酸溶液后定容，制成混合有機酸的標準供試溶液，取上清液過0.22 μm 針孔濾膜后直接進樣。

1.2.1.3 磷酸鹽種類的選擇

分別配制溶度為0.08 mol/L 的磷酸氫二銨溶液和磷酸二氫鉀流動相，pH 值為2.90，進樣量為20 μL，柱溫為30 ℃，流速為1.00 mL/min，檢測波長為215 nm。

1.2.1.4 磷酸鹽濃度的選擇

分別配制溶度為 0.01、0.05、0.08 mol/L 的磷酸二氫鉀流動相，pH 值為 2.90，進樣量為 20 μL，柱溫為30 ℃，流速為1.00 mL/min，檢測波長為215 nm。

1.2.1.5 pH 值的選擇

配制溶度為0.01 mol/L 磷酸二氫鉀流動相，調節pH 值分別為 2.90、2.50 和 2.30，進樣量為 20 μL，柱溫為30 ℃，流速為1.00 mL/min，檢測波長為215 nm。

1.2.1.6 有機相的選擇

分別設置乙腈和水相的體積比為 0 ∶100、5 ∶95 和10 ∶90，流動相為 0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液，pH 值為2.90，進樣量為 20 μL，柱溫為 30 ℃，流速為 1.00 mL/min，檢測波長為215 nm。

1.2.1.7 流速的選擇

分別設置流速為 0.05、0.80、1.00 、1.20 mL/min，流動相為0.01 mol/L 磷酸二氫鉀，pH 值為2.90，進樣量為20 μL，柱溫為30 ℃，檢測波長為215 nm。

1.2.1.8 柱溫的選擇

分別設置柱溫為25、30、35 ℃，流動相為0.01 mol/L磷酸二氫鉀，pH 值為2.90，進樣量為20 μL，流速為1.00 mL/min，檢測波長為215 nm。

1.2.2 獼猴桃酒中4 種有機酸的測定

1.2.2.1 獼猴桃酒的制作

稱取成熟獼猴桃洗凈打漿，添加4 g 的偏重亞硫酸鉀和0.06%的果膠酶攪拌均勻后調節糖度為22°Brix，接種60 g 釀酒酵母6 h 后分裝并按107CFU/mL 獼猴桃酒添加量分別接入10株植物乳桿菌，于22 ℃發酵7 d，再18 ℃進行后發酵20 d 后待用，其編號為GJ1～GJ10。

1.2.2.2 標準曲線的制備

分別吸取 0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mL 不同母液于10 mL 容量瓶，加0.20 mL 的0.10 mol/L 磷酸溶液后定容，配制出不同梯度標準品溶液，溶液過0.22 μm 的針孔濾膜待用。分別以4 種有機酸的濃度為自變量x，峰面積為因變量y，采用外標法進行計算。

色譜條件：流動相為0.01 mol/L 磷酸二氫鉀，pH值為2.90；進樣量為20 μL，柱溫為30 ℃，流速為1.00 mL/min，檢測波長為215 nm。

1.2.2.3 獼猴桃酒中4種有機酸含量的測定

吸取2.0 mL 獼猴桃酒于10 mL 容量瓶中，加入0.20 mL 的 0.10 mol/L 磷酸溶液，用 0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液定容。混合均勻后轉移至離心管中10 000 r/min離心15 min，取上清液過0.22 μm 針孔濾膜后直接進樣，按照1.2.2.2 的色譜條件進行4 種有機酸含量的測定。

1.2.3 方法性能研究

1.2.3.1 精密性試驗

將1.2.1.2 中的供試樣品溶液連續進樣7 次，分別對檸檬酸、蘋果酸、乳酸和奎寧酸的峰面積進行測定，然后計算其相對標準偏差值（relative standard deviation，RSD）。色譜條件同 1.2.2.2。

1.2.3.2 重復性試驗

取GJ1 樣品2 mL 于10 mL 容量瓶中，并加入0.20 mL 的0.01 mol/L 磷酸溶液，用0.01 mol/L 磷酸二氫鉀定容。混合均勻后轉移至離心管中10 000 r/min離心15 min，取上清液過0.22 μm 針孔濾膜待用。按照1.2.2.2 的色譜條件對其峰面積進行測定，試驗重復操作7 次。

1.2.3.3 加標回收率試驗

取1.2.3.2 中濾液4 份，分別編號為GJ11、GJ12、GJ13 和 GJ14，其中 GJ11 不做任何處理，GJ12、GJ13 和GJ14 分別加入不同濃度標準品混合溶液，色譜條件同1.2.2.2。

1.3 統計學分析

使用高效液相色譜工作站自帶的LCsolution 軟件將色譜圖另存為數據矩陣后，使用Origin 8.5 軟件（O－riginLab，MA，ΜSA）作圖。使用高效液相色譜工作站自帶的LCsolution 軟件對4 種有機酸進行定性和定量分析。采用保留時間對有機酸種類進行定性，采用外標法對有機酸進行定量。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 磷酸鹽的選擇

磷酸二氫鉀和磷酸氫二銨對4 種有機酸保留時間及分離效果的影響如圖1所示。

圖1 流動相磷酸鹽種類對4 種有機酸分離效果的影響Fig.1 Effects of phosphate type of mobile phase on the separation of 4 kinds organic acids

由圖1 可知，當選擇磷酸鹽作為流動相時，4 種有機酸都能得到較好的分離，且當選擇磷酸氫二銨時，各有機酸的保留時間相較于磷酸二氫鉀小，檢測時間更短。但對比兩圖可知，以磷酸氫二銨作為流動相時，奎寧酸、乳酸和檸檬酸的峰形相較之磷酸二氫鉀差，出現拖尾現象。因此，本研究選擇使用磷酸二氫鉀作為流動相。

2.1.2 流動相中磷酸鹽濃度的選擇

濃度為 0.01、0.05、0.08 mol/L 磷酸二氫鉀對 4 種有機酸保留時間及分離效果的影響如圖2所示。

圖2 流動相磷酸二氫鉀濃度對4 種有機酸分離效果的影響Fig.2 Effects of monopotassium phosphate concentration in mobile phase on the separation of 4 kinds organic acids

由圖2 可知，磷酸二氫鉀的濃度對于4 種有機酸的保留時間和峰形均具有一定的影響，對比3 個不同磷酸二氫鉀濃度的色譜圖可知，隨著磷酸二氫鉀濃度的降低4 種有機酸的保留時間也相應的縮短，從而縮短單次分析的時間。同時，觀察3 號和4 號峰可知，隨著磷酸二氫鉀濃度的升高，3 號和4 號峰的峰形也越差，且當磷酸二氫鉀的濃度為0.08 mol/L 時，基線出現下偏。因此，本研究選擇0.01 mol/L 的磷酸二氫鉀溶液作為流動相。

2.1.3 流動相pH 值的選擇

pH 值為 2.30、2.50 和 2.90 的磷酸二氫鉀流動相對4 種有機酸保留時間及分離效果的影響如圖3所示。

圖3 流動相pH 值對4 種有機酸分離效果的影響Fig.3 Effect of pH of mobile phase on the separation of 4 kinds organic acids

由圖3 可知，流動相的pH 值對4 種有機酸的保留時間和峰形均存在較大的影響，對比不同pH 值的色譜圖可知，隨著pH 值的上升4 種有機酸的保留時間均有較大的縮短，特別是檸檬酸的保留時間由7.20 min縮短至5.90 min。由圖3 亦可知，當pH 值為2.30 時，基線并不穩定，而有向上漂移的趨勢；當pH 值為2.50時，3 號峰和4 號峰的分離度過大，保留時間相對較長，且對比 3 個圖發現，pH 值為 2.30 和 2.50 時，均出現不同程度的拖尾現象。因此，本研究選擇磷酸鹽溶液的pH 值為2.90。

2.1.4 流動相中有機相比例的選擇

調節乙腈和磷酸鹽溶液的體積比分別為0 ∶100、5 ∶95 和 10 ∶90，研究其對 4 種有機酸保留時間及分離效果的影響，結果如圖4所示。

圖4 流動相中乙腈比例對4 種有機酸分離效果的影響Fig.4 The effect of acetonitrile percentage in mobile phase on the separation of 4 kinds organic acids

由圖4 可知，隨著有機相比例的不斷增加，4 種有機酸的保留時間也不斷縮短，且峰形、分離度和響應信號均發生了較大變化。對比3 個圖可知，當乙腈添加比例為0 時，4 種有機酸能達到很好的分離效果；而當乙腈的添加比例為5%或10%時，4 種有機酸并不能達到相應的分離效果，且與不添加乙腈相比，添加乙腈以后的檢測基線并不穩定且噪音較大。因此，本研究選擇不添加乙腈。

2.1.5 流速的選擇

流動相流速為 0.05、0.80、1.00、1.20 mL/min 時對 4種有機酸保留時間及分離效果的影響如圖5所示。

圖5 流動相流速對4 種有機酸分離效果的影響Fig.5 Effect of flow rate of mobile phase on the separation of 4 kinds organic acids

由圖5 可知，流速對4 種有機酸的保留時間的峰形具有較大影響，隨著流速的增加，4 種有機酸的保留時間會有明顯的縮短，值得注意的是，當流速為1.00 mL/min和1.20 mL/min 時，檸檬酸的保留時間并沒有較大差異。由圖5 亦可知，隨著流速的降低，4 種有機酸峰寬逐漸增加，且出現較為明顯的拖尾現象，而對比流速為1.00 mL/min 和1.20 mL/min 時的色譜圖發現，流速為1.20 mL/min 時檸檬酸的峰形較差且壓力相對較高。因此，本研究選擇流速為1.00 mL/min。

2.1.6 柱溫的選擇

柱溫箱的溫度為25、30、35 ℃時對4 種有機酸保留時間及分離效果的影響如圖6所示。

圖6 柱溫對4 種有機酸分離效果的影響Fig.6 Effect of column temperature on the separation of 4 kinds organic acids

由圖6 可知，柱溫對于奎寧酸、蘋果酸和乳酸的保留時間并沒有較大影響，而對檸檬酸的保留時間影響卻較大，當柱溫為30 ℃時，單次分析時間最短。由圖6亦可知，當柱溫為25 ℃和35 ℃，蘋果酸、乳酸和檸檬酸的峰形相較于30 ℃時的峰形差。因此本研究選擇柱溫為30 ℃。

2.2 獼猴桃酒中4 種有機酸含量的測定

2.2.1 標準回歸方程

分別以4 種有機酸的濃度為自變量x，色譜峰面積為因變量y 進行標準曲線回歸方程的計算，結果如表1。

表1 4 種有機酸回歸方程Table 1 Linear regression equations of detection for 4 kinds organic acids

由表1 可知，4 種有機酸的線性回歸方程的相關系數均在0.999 0 以上，可見各有機酸在濃度范圍內具有良好的線性關系。同時其檢出限在4.50 mg/L～6.60 mg/L 之間，具有較高的精度，可以滿足試驗要求。

2.2.2 獼猴桃酒中4 種有機酸含量的測定

使用HPLC 法對10 個獼猴桃酒樣品中4 種有機酸測定的結果如表2所示。

表2 HPLC 法測定獼猴桃酒中4 種有機酸含量（n=10）Table 2 Contents of 4 kinds organic acids in 10 kiwifruit wine samples（n=10）

由表2 可知，10 種獼猴桃酒中均檢測出奎寧酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸，其含量范圍分別為7.83 mg/mL～8.60 mg/mL、7.17 mg/mL ～7.66 mg/mL、0.84 mg/mL ～0.94 mg/mL 和 4.53 mg/mL～6.09 mg/mL。由此可見，奎寧酸、蘋果酸和檸檬酸為獼猴桃酒中的主要有機酸。

2.3 方法性能研究

2.3.1 精密性試驗結果

將1.2.1.2 中的供試樣品溶液連續進樣7 次，分別對4 種有機酸的峰面積進行測定，然后計算其相對標準偏差值（relative standard deviation，RSD），精密度試驗結果如表3所示。

由表3 可知，奎寧酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸的相對標準偏差值均在0.10%以下，因而使用本研究優化的色譜條件測定獼猴桃酒中4 種有機酸時具有良好的精密性。

2.3.2 重復性試驗結果

按照1.2.2.2 中的色譜條件對GJ1 獼猴桃果酒中各有機酸含量進行測定，試驗重復操作7 次，計算4 種有機酸峰面積的RSD，重復性試驗結果如表4所示。

表3 精密度試驗結果Table 3 Precision experiment results

表4 重復性試驗結果Table 4 Repetitive test results

由表4 可知，奎寧酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸的相對標準偏差值均在1.00%以下，因而使用本研究優化的色譜條件測定獼猴桃酒中4 種有機酸時具有良好的重復性。

2.3.3 加標回收試驗結果

參照1.2.2.2 中的色譜條件進行加標回收率試驗，其結果如表5所示。

由表5 可知，奎寧酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸其平均回收率分別為100.19%、99.64%、99.25%和99.67%，因而使用本研究優化的色譜條件測定獼猴桃酒中4 種有機酸時可以很好的滿足試驗要求。

表5 加標回收率試驗結果Table 5 Spiking recovery test results

續表5 加標回收率試驗結果Continue table 5 Spiking recovery test results

3 結論

本研究建立了反相高效液相色譜法快速測定獼猴桃酒中奎寧酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸的方法，流動相為0.01 mol/L 磷酸二氫鉀，pH 值2.90，色譜柱為InertSustainSwift C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速為1.00 mL/min，柱溫為 30 ℃，進樣量為 20 μL，檢測波長為215 nm，采用該方法分析發現，奎寧酸、蘋果酸和檸檬酸為獼猴桃酒中的主要有機酸。