消癌平注射液調節核受體增強紫杉醇抑制卵巢癌A2780細胞增殖的機制*

張湘奇，陳君君，楊姣，，石美智，祁美娟，肖霄，王洪斌，韓永龍，

(1.上海交通大學附屬第六人民醫院藥劑科，上海 200233；2.上海健康醫學院附屬第六人民醫院東院藥劑科，上海 201306；3.上海海洋大學食品學院，上海 201306；4.北加州大學藥學院，美國加利福尼亞 CA95757)

消癌平注射液(xiaoaipinginjection，XAP)是由通關藤藥材精制提取而成的中藥抗腫瘤單方制劑，在臨床上常與紫杉醇[1]、吉非替尼[2]、多柔比星[3]等化學治療(化療)藥物聯合應用治療肺癌、肝癌、胃腸腫瘤等，對化療藥物具有增效減毒作用，可以提高化療藥物的療效。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是卵巢癌的一線化療藥物，但毒性大，易引起耐藥[4]；它在人體內主要經藥物代謝酶細胞色素P450酶(CYP)的亞型CYP3A4/5、CYP2C8和轉運體P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)進行代謝消除[5-7]。本課題組前期研究和文獻報道均發現XAP可抑制肝微粒體中CYP3A4、CYP2C8活性，從而可能影響PTX在體內的代謝過程。核受體孕烷X受體(PXR)和組成型雄甾烷受體(CAR)可以調控包括細胞色素P450酶，如CYP3A4、CYP2B6、CYP2C8等及轉運體如P-gp等眾多靶基因的轉錄表達[8-9]；同時有研究表明抑制PXR和CAR的表達，可抑制卵巢癌細胞的增殖并增加其對PTX的敏感性[10-11]。因此，本研究擬在前期工作基礎上從細胞水平探究XAP聯用PTX對卵巢癌A2780細胞的增殖抑制作用，通過分析mRNA、蛋白表達變化明確XAP是否調節核受體PXR和CAR及下游的藥物代謝酶來增強PTX抑制A2780細胞增殖。

1 材料與方法

1.1實驗藥品及試劑 消癌平注射液(XAP，南京圣和藥業有限公司，批號：201709111，規格：每支20 mL，每毫升注射液含生藥1 g)，紫杉醇注射液(PTX，海口市制藥廠有限公司，批號：12171006，規格為5 mL：30 mg)，胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素溶液(GIBCO公司)，高糖達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM，HYCLONE公司)，噻唑藍(MTT，索萊寶生物科技有限公司)，UNIQ-10 柱式Trizol總RNA抽提試劑盒、M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒、2X SG Fast qPCR預混液(生工生物工程公司)，Anti-PXR抗體、Anti-CYP2C8抗體(ABCAM公司)，β-actin小鼠單克隆抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、RIPA裂解液(碧云天生物技術公司)，山羊抗小鼠IgG HRP、山羊抗兔IgG HRP(BIOSHARP公司)。

1.2細胞 人卵巢癌細胞系A2780，購自北納生物公司。

1.3儀器 生物安全柜(ESCO Class II BSC)、二氧化碳(CO2)培養箱(Panasonic MCO-18AIC)、ME203電子分析天平(梅特勒-托利多儀器公司，感量：1 mg)、臺式低溫離心機(Beckman Microfuge 20R)、多功能酶標儀(Spectra Max i3x)、定量PCR儀(ABI Pro Flex)、實時熒光定量PCR儀(Roche Light Cycler 480II)、蛋白垂直電泳系統(Bio-rad mini-protean Tetra)、倒置相差熒光顯微鏡(Leica DMi8)。

1.4細胞的培養 卵巢癌細胞A2780培養于含10%胎牛血清，1%青霉素：鏈霉素溶液(使青霉素和鏈霉素終濃度分別為100 U·mL-1和100 μg·mL-1)的DMEM高糖完全培養基中，培養條件為37 ℃，5%CO2飽和濕度。培養2或3代后，取對數生長期細胞進行實驗。

1.5MTT 法檢測細胞活力 調整細胞懸液密度至5×104·mL-1，接種于96孔培養板中，每孔100 μL，空白組加入相應量的無細胞培養基。細胞貼壁后根據藥物濃度梯度加入含藥培養基，XAP濃度梯度為20，40，80，160 mg·mL-1，PTX濃度梯度為10，40，80，160 nmol·L-1，各濃度PTX分別單用或與XAP 40 mg·mL-1聯用，對照組和空白組加入無藥培養基，37 ℃、5%CO2培養24和48 h。用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解MTT粉末，制成5 mg·mL-1MTT溶液，各孔加入MTT溶液10 μL繼續孵育4 h。棄去上清液，加入DMSO150 μL振蕩，溶解紫色晶體10 min。用酶標儀測定在490 nm 波長下各孔的吸光度(A)值。計算細胞活力(%)=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%，細胞活力值越低說明藥物抑制率越高。平行實驗重復3次。

1.6細胞形態觀察 收集對數生長期A2780細胞，制成密度為1×105·mL-1的細胞懸液，接種于6孔培養板中，每孔1 mL。細胞貼壁過夜后，根據藥物分組，分別加入含藥培養基，使終濃度分別為XAP 40 mg·mL-1、PTX 10 nmol·L-1、XAP 40 mg·mL-1+ PTX 10 nmol·L-1，空白對照組只加入無藥培養基。加藥作用細胞24和48 h后，用PBS溶液輕柔清洗3次，置于倒置相差熒光顯微鏡下觀察攝像。

1.7RT-PCR檢測mRNA的表達 A2780細胞接種于6孔板中，每孔5×105個細胞，細胞貼壁后用無血清培養基處理12 h，加入含藥培養基，使終濃度分別為XAP 40 mg·mL-1、PTX 10 nmol·L-1、XAP 40 mg·mL-1+ PTX 10 nmol·L-1，空白對照組只加入無藥培養基。作用12和24 h后，利用Trizol法提取總RNA，用酶標儀測定所提RNA純度及濃度。按上樣1000 ng計算各樣品上樣量，依照逆轉錄試劑盒說明書配制20 μL上樣體系加入PCR小管中，置于PCR擴增儀，按42 ℃、45 min 合成cDNA，70 ℃、10 min終止反應的條件進行逆轉錄反應。以逆轉錄得到的cDNA為模板，按PCR擴增說明書，加入相應量的擴增溶液及引物，20 μL上樣體系中含25 ng模板DNA、10 μmol·L-1引物、10 μLRT-PCR Master Mix，96孔檢測板離心后，放入熒光定量PCR儀上，PCR反應條件：①酶激活 95 ℃ 3 min ②變性 95 ℃ 3 s，退火延伸 60 ℃ 30 s，進行40個循環后降溫得融解曲線，驗證引物特異性。引物序列見表1。

表1 RT-PCR擴增所用的基因引物序列

Tab.1PrimersequencesoftargetgenesinRT-PCRamplification

基因名稱引物序列(5′→3′)PXRForward :TGTGAGTGCGTGTGTGTGATReverse :TGATTGTCAGCGTAGCCTTGCARForward :GCTGCAAGAGGAGATGGCACTGReverse :CAGCGGCATCATGGCAGACAGCYP2C8Forward :TCCTGTGTTCACCGTGTATTReverse :TCAATCAGGGCTTCCTTCACCYP3A4Forward :TCATTGCTGTCTCCAACCTTCACCReverse :GGCTTGCCTGTCTCTGCTTCCCYP3A5Forward :CCGACGTGATCAGAACAGTGCTAGReverse :TGGTGAAGGTTGGAGACAGCAATGP-gpForward :GATTGCTCACCGCCTGTCCACReverse :CGTGCCATGCTCCTTGACTCTG

1.8Western blotting檢測蛋白的表達 A2780細胞接種于6孔板中，每孔5×105個細胞，貼壁后用無血清培養基處理12 h，加入含藥培養基，使終濃度分別為XAP 40 mg·mL-1、PTX 10 nmol·L-1、XAP 40 mg·mL-1+ PTX 10 nmol·L-1，空白對照組只加入無藥培養基。作用24和48 h后，用預冷PBS洗滌1次，每孔加入含1%PMSF的RIPA裂解液200 μL，冰上裂解30 min，12 000×g離心20 min，收集上清液即為細胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，加入5倍上樣緩沖液，沸水浴5 min。取蛋白25 μg進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳，恒壓180 V電泳30 min，然后換80 V電泳40 min，將膠上分離的蛋白電轉到NC膜上，電轉條件為半干電轉恒壓25 V持續30 min，以5%脫脂牛奶室溫搖動封閉2 h，加入一抗(1：1000比例稀釋)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜5次后以電化學發光(electrochemiluinescence，ECL)試劑盒檢測蛋白印跡。以內參β-actin(ACTB)進行上樣量校正。

2 結果

2.1對A2780細胞活力的抑制作用 實驗結果顯示，XAP對細胞增殖的抑制作用呈現顯著的時間依賴(P<0.05或P<0.01)，見圖1。各濃度PTX對A2780細胞活力的抑制作用并不顯著，當作用時間延長，抑制作用隨藥物濃度升高而增強，最大抑制率約為50%。各濃度PTX與XAP 40 mg·mL-1聯用，可顯著抑制A2780細胞活力，且與PTX組比較，抑制率顯著增加(P<0.05或P<0.01)，兩藥具有協同作用(圖2)。通過Graphpad 6.0版軟件分析可得：兩藥聯用24 h，PTX的半數抑制濃度(IC50)由917.823 nmol·L-1降至384.541 nmol·L-1；兩藥聯用48 h，PTX的IC50由97.022 nmol·L-1降至28.340 nmol·L-1。結果表明，XAP可顯著抑制A2780細胞的增殖，且隨著藥物濃度升高及作用時間延長，抑制率升高；與PTX聯用后，與PTX組比較，抑制作用增強，IC50明顯降低。根據上述結果，選用XAP40 mg·mL-1+PTX10 nmol·L-1進行后續實驗。

與24 h比較，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with 24 h，*1P<0.05，*2P<0.01

2.2對A2780細胞形態的影響 藥物作用24 h后，對照組細胞形態呈上皮型貼壁生長，大小均一，緊密排列，形狀多為多角形或類圓形，生長旺盛；XAP組貼壁細胞數較對照組減少，細胞較完整；PTX組及XAP+PTX組貼壁細胞數明顯減少，視野中可見皺縮飄浮的死細胞，貼壁細胞內顆粒增多；對比發現，XAP+PTX組細胞數明顯少于PTX組，細胞排列稀疏，形狀不規則，伴有較多飄浮的死細胞和細胞碎片。藥物作用48 h后，各藥物組細胞形態變化與24 h相似，細胞碎片和皺縮漂浮的死細胞數量更為增多，見圖3。

2.3對A2780細胞PXR和CAR的mRNA表達水平的影響 各組藥物分別作用12和24 h后，提取細胞總RNA，經過反轉錄、兩步法擴增cDNA，按2-ΔΔCt相對定量法計算目標片段的mRNA相對表達水平。擴增結果顯示，加藥作用12和24 h后，與對照組比較，PTX10 nmol·L-1組PXR mRNA表達顯著增加(P<0.01)，而PTX與XAP 40 mg·mL-1聯用后，PXR mRNA表達與PTX組相比均顯著降低(P<0.01)，表達水平接近對照組(圖4)。藥物作用12 h后，XAP+PTX組CAR mRNA表達低于PTX組，加藥24 h后XAP+PTX組CAR mRNA表達水平也低于PTX組，但差異無統計學意義(圖5)。結果提示，PTX可顯著上調A2780中PXR mRNA表達，與XAP聯用后，PXR mRNA的表達被抑制。

2.4對A2780細胞內CYP2C8、CYP3A4、CYP3A5和P-gp mRNA表達水平的影響 各藥物作用12和24 h后，與對照組比較，PTX10 nmol·L-1組CYP2C8 mRNA表達顯著增加(P<0.01)，而PTX+XAP組CYP2C8 mRNA表達與PTX組相比明顯降低(P<0.01)(圖6)。各藥物作用12和24 h后，CYP3A4 mRNA的表達變化趨勢與CYP2C8相似，但僅PTX作用12 h可導致CYP3A4 mRNA表達顯著增加(P<0.05)，其余各組均差異無統計學意義(圖7)。各藥物作用12和24 h后，CYP3A5和P-gp mRNA表達變化均差異無統計學意義，見圖8，9。結果提示，PTX能夠顯著上調A2780細胞中CYP2C8和CYP3A4 mRNA的表達，與XAP聯用后，CYP2C8的表達水平降低。

與PTX組比較，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with PTX group，*1P<0.05，*2P<0.01

圖3 XAP和PTX作用于A2780細胞24和48 h后形態(×200)

與對照組比較，*1P<0.01；與PTX組比較，*2P<0.01

Compared with control group，*1P<0.01； Compared with PTX group，*2P<0.01

2.5對A2780細胞內PXR和下游藥物代謝酶CYP2C8蛋白表達水平的影響 Western blotting結果顯示，藥物作用24 h，與對照組比較，PTX10 nmol·L-1組PXR和CYP2C8蛋白表達升高；與XAP聯用后，因PTX激活PXR、CYP2C8蛋白表達降低，但差異無統計學意義(圖10)。藥物作用48 h，PTX 10 nmol·L-1組PXR、CYP2C8蛋白表達高于對照組，XAP和PTX合用可顯著抑制PXR、CYP2C8蛋白的表達(P<0.05)(圖11)。結果提示，XAP+PTX可抑制由PTX激活的PXR、CYP2C8的蛋白表達。

3 討論

卵巢癌是婦科腫瘤中發病率第二、病死率第一的惡性腫瘤，PTX作為卵巢癌的一線化療藥物，目前已在臨床上廣泛應用。但其嚴重的毒副反應[12]和易引發耐藥[13]的特點，影響它的療效，因此臨床常將PTX與其他抗癌藥物聯用[14]，以期達到增加藥效、逆轉耐藥的治療效果。近年來，化療藥物與中藥聯用逐漸引起重視，PTX與人參皂苷[15]、香菇多糖[16]、白藜蘆醇[17]等中藥單體或提取物聯用均已證實對腫瘤治療有一定增效作用。

與對照組比較，*1P<0.01；與PTX組比較，*2P<0.01

Compared with control group，*1P<0.01； Compared with PTX group，*2P<0.01

與對照組比較，*1P<0.05

Compared with control group，*1P<0.05

XAP可單用治療肺癌、肝癌、胃腸腫瘤，聯合放化療治療非小細胞肺癌等惡性腫瘤[18]，具有增效減毒的作用，能明顯提高放化療的臨床療效。有研究表明，XAP可阻滯腫瘤細胞周期[19]；誘導腫瘤細胞凋亡；甚至可以逆轉腫瘤耐藥，提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。本研究首先探究XAP單用和與PTX聯用對卵巢癌A2780細胞增殖的抑制作用，尋找適合進行后續實驗的藥物濃度。由于XAP是中藥制劑，故藥物濃度用每毫升含有生藥量表示。通過預實驗確定實驗藥物濃度為XAP 20，40，80，160 mg·mL-1和PTX 10，40，80，160 nmol·L-1，MTT實驗結果證明，XAP對腫瘤細胞活力的抑制作用隨濃度增加和作用時間延長而顯著增強，此結果與已發表文獻基本一致[2]。在與PTX聯用24和48 h后，PTX對細胞增殖的抑制作用明顯增強，PTX的IC50降低2～3倍。依據此實驗結果，選用XAP40 mg·mL-1單用時對A2780細胞抑制率約為25%，且聯合用藥時可顯著降低細胞存活率至40%～60%的藥物濃度進行后續實驗。而較高濃度XAP(80 mg·mL-1)與PTX聯用后對細胞形態及密度影響太大，不適合采用此濃度進行聯合作用機制的研究。

與對照組比較，*1P<0.05；與PTX組比較，*2P<0.05

Compared with control group，*1P<0.05； Compared with PTX group，*2P<0.05

PTX在人體內主要是經由藥物代謝酶CYP2C8、CYP3A4/5和轉運體P-gp介導的代謝消除，其中2/3的代謝清除是經由CYP2C8代謝轉化為6α-羥基紫杉醇，而核受體PXR、CAR被證實可以調控多種藥物代謝酶的轉錄表達，其中就包括CYP2C8、CYP3A4等CYP酶及轉運體P-gp，且PXR、CAR底物種類繁多，PTX就是其激活劑之一，對PXR和CAR激活或抑制都會引起下游代謝酶及轉運體的表達變化。本課題組前期研究發現XAP可以抑制人肝微粒體CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19及CYP3A4/5的活性[20]，故需要在細胞分子水平上證明XAP與PTX聯合增效作用及其對核受體PXR/CAR和下游藥物代謝酶和轉運體在mRNA和蛋白水平表達量的變化。本研究采用RT-PCR的方法檢測消癌平注射液對PXR和CAR兩種核受體mRNA及紫杉醇的主要代謝酶CYP2C8、CYP3A4/5和轉運體P-gp mRNA的影響，結果顯示，PTX作用12和24 h均可顯著增強細胞中核受體PXR mRNA的表達，進而引起其下游藥物代謝酶CYP2C8 mRNA的表達水平顯著升高，而聯用PTX后，PXR和CYP2C8的mRNA水平明顯降低。為檢測XAP對mRNA翻譯后蛋白表達的影響，筆者采用Western blotting檢測有顯著改變的基因編碼的蛋白的表達情況。結果顯示，XAP作用48 h對PXR和CYP2C8蛋白的表達有顯著抑制作用，證實在卵巢癌A2780細胞內核受體PXR與藥物代謝酶CYP2C8表達呈正相關性，XAP可以抑制核受體PXR，影響XAP經CYP2C8的代謝消除，從而增加PTX在腫瘤細胞內的濃度，導致PTX藥效增強。以往研究中藥與PTX聯用增效的角度大都局限在腫瘤凋亡、自噬等機制，本研究創新性地將核受體-藥物代謝酶途徑對PTX藥效的影響作為立足點，探究中藥制劑XAP通過影響PTX代謝效率而增強其藥效的作用，為中藥化療藥聯用增效機制提供了新思路。

綜上所述，XAP可增強PTX對卵巢癌A2780細胞生長的抑制作用，其機制可能與XAP抑制PTX對PXR的激活和下游藥物代謝酶CYP2C8的表達，從而影響PTX代謝消除過程，增強腫瘤細胞對PTX敏感性有關。以上結果提示，XAP與PTX聯用對卵巢癌的治療有一定增效作用，為臨床上XAP與PTX聯用提供理論依據。但此實驗僅為體外細胞實驗，還需要進一步在體內實驗及酶活性實驗中對兩藥的聯合作用效果和作用機制進行驗證。