基于整合藥理學(xué)平臺(tái)天麻治療頭痛的作用機(jī)制*

周榮榮，李培碩，關(guān)偉，王麗萍，李彥文，李志勇

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，晉中 030600；2.吉林省鎮(zhèn)賚縣人民醫(yī)院，白城 030024；3.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所，北京 100700；4.中央民族大學(xué)藥學(xué)院，北京 100081)

有關(guān)研究表明，原發(fā)性頭痛是卒中的危險(xiǎn)因素[1]，偏頭痛可增加全腦卒中、缺血性卒中的風(fēng)險(xiǎn)[2]。近年來，頭痛的患病率升高，已引起全球性重視。據(jù)調(diào)查，偏頭痛已上升為2013年全球疾病負(fù)擔(dān)(Global Burden of Disease，GBD)的第6位[3]，在全世界致殘疾病的第3位[4]；當(dāng)前頭痛主要依靠藥物和預(yù)防性治療，如阿片類藥物或靜脈注射氯胺酮等治療方法[5]，但治療效果并不樂觀，頭痛的防治越來越成為亟待解決的問題。

頭痛屬中醫(yī)學(xué)“頭痛”“頭風(fēng)”范疇。《普濟(jì)方》認(rèn)為：“氣血俱虛，風(fēng)邪傷于陽經(jīng)...，則令人頭痛”；現(xiàn)代研究總結(jié)頭痛多因感受外邪、肝火上擾、肝陽上亢、痰瘀阻絡(luò)、風(fēng)痰上擾、氣血虧虛等所致[6]。天麻為蘭科植物天麻(GastrodiaelataBl.)的干燥塊莖，以“赤箭”之名始見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性味甘，平，歸肝經(jīng)；功效能息風(fēng)止痙，平抑肝陽，祛風(fēng)通絡(luò)，天麻是治療頭痛肝陽上亢、痰阻經(jīng)絡(luò)證的基礎(chǔ)藥。如李東垣《脾胃論》言：“足太陰痰厥頭痛......眼黑頭眩，風(fēng)虛內(nèi)作，非天麻不能除”；《本草匯言》言天麻：“主頭風(fēng)，頭痛，頭暈虛眩......一切中風(fēng)，風(fēng)痰”。現(xiàn)代研究也表明天麻具有調(diào)節(jié)促進(jìn)突觸可塑性和神經(jīng)修復(fù)、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等作用[7]，但天麻治療頭痛的機(jī)制仍不十分明確。

中藥整合藥理學(xué)計(jì)算平臺(tái)V1.0(http：//www.tcmip.cn/)是以中醫(yī)藥大數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過人工智能、數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科結(jié)合的方法，一站式完成“中藥-多成分-多靶點(diǎn)-疾病”之間網(wǎng)絡(luò)關(guān)系計(jì)算，可有效預(yù)測(cè)中藥的潛在藥效、分子作用機(jī)制等[8]。筆者通過中藥整合藥理學(xué)平臺(tái)，探究天麻有效化學(xué)成分及治療頭痛的分子機(jī)制，為天麻臨床實(shí)驗(yàn)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1資料來源 數(shù)據(jù)由中藥整合藥理學(xué)計(jì)算平臺(tái)的中藥材數(shù)據(jù)庫、中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫、疾病/癥狀靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫提供。與中藥、疾病相關(guān)的靶標(biāo)基因及相關(guān)生物信息資源來源于Drugbank，OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)，HPO(Human Phenotype Ontology)，GO(gene ontology)，TTD(Therapeutic Target Database)，KEGG( Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)等數(shù)據(jù)庫。蛋白-蛋白相互作用信息(PPI)整合藥理學(xué)平臺(tái)鑲嵌HAPPI，Reactome，OPHID，In Act，HPRD，PDZBase，MINT，DIP等數(shù)據(jù)庫中蛋白-蛋白相互作用數(shù)據(jù)。3種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征值“連接度(degree)”“介度(betweenness)”“緊密度(closeness)”設(shè)定以確定中藥矯正疾病失衡網(wǎng)絡(luò)的候選靶標(biāo)。通過GO和KEGG數(shù)據(jù)庫，確定靶標(biāo)基因、蛋白質(zhì)分子功能、細(xì)胞內(nèi)定位及其所參與的生物學(xué)反應(yīng)和通路。

1.2研究步驟

1.2.1信息設(shè)定 登陸中藥整合藥理學(xué)平臺(tái)，新建“天麻-頭痛”任務(wù)，檢索中藥材數(shù)據(jù)庫將“天麻”信息添加保存，得到21種化學(xué)成分；以“頭痛”相關(guān)的英文名稱“Headache”“Migraine”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，將檢索結(jié)果保存得到頭痛疾病相關(guān)的靶標(biāo)。

1.2.2靶標(biāo)預(yù)測(cè) 設(shè)置相似性分?jǐn)?shù)0.8，整合藥理學(xué)平臺(tái)，通過化學(xué)成分二維結(jié)構(gòu)(.mol或.sdf)相似性與美國食品藥品管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)上市藥物進(jìn)行比對(duì)，以Tanimoto系數(shù)定義的相似度計(jì)量方法進(jìn)行相似性打分，信息設(shè)定與相似性分?jǐn)?shù)設(shè)置完成后，點(diǎn)擊“確認(rèn)”。

1.2.3一站式計(jì)算 平臺(tái)智能進(jìn)行“靶標(biāo)預(yù)測(cè)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作(PPI)、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、核心靶標(biāo)(Core targets)的篩選、可視化等”一站式分析，生成報(bào)告。

1.2.4拓?fù)涮卣髦?以“節(jié)點(diǎn)連接度”的 2倍中位數(shù)為卡值，選取中藥靶標(biāo)-疾病基因互作網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)；在此基礎(chǔ)上，選取同時(shí)滿足節(jié)點(diǎn)“連接度”“緊密度”“介度”中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)，構(gòu)建中藥潛在靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)之間相互作用的關(guān)鍵靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1天麻所含化學(xué)成分和藥物靶標(biāo)預(yù)測(cè) 天麻化學(xué)成分21種，主要有酚類、多糖類、氨基酸、甾醇類等多種化學(xué)成分，研究表明天麻素(gastrodin)、香草醇(vanillyl alcohol)、4-(4'-羥基芐氧基)芐基甲基醚(4-(4'-Hydroxybenzyloxy)benzyl methyl ether)、p-羥基苯甲醇(p-Hydroxybenzyl alcohol)、香草醛(vanillin)等是天麻的主要神經(jīng)藥理學(xué)活性成分[9]，尤其是天麻素已明確其在痙攣性疾病、頭暈和頭痛、神經(jīng)損傷等方面有顯著效果[10]；對(duì)天麻的化學(xué)成分進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測(cè)，相似性分?jǐn)?shù)為0.8時(shí)，天麻的預(yù)測(cè)靶標(biāo)數(shù)355個(gè)，其中天麻素預(yù)測(cè)靶標(biāo)數(shù)71個(gè)、雙(4-羥基苯基)乙醚預(yù)測(cè)靶標(biāo)數(shù)68個(gè)、蔗糖預(yù)測(cè)靶標(biāo)數(shù)83個(gè)、十六烷酸(棕櫚酸)預(yù)測(cè)靶標(biāo)數(shù)49個(gè)等。

2.2天麻預(yù)測(cè)靶標(biāo)GO富集分析、KEGG通路富集分析 對(duì)天麻的預(yù)測(cè)靶標(biāo)進(jìn)行GO富集分析、KEGG通路富集分析，結(jié)果均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，得到GO富集分析結(jié)果486條和KEGG通路富集分析結(jié)果35條，發(fā)現(xiàn)天麻的預(yù)測(cè)靶標(biāo)與檸檬酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle)、琥珀酸代謝過程(succinate metabolic process)、異檸檬酸代謝過程( isocitrate metabolic process)、琥珀酸脫氫酶活性(succinate dehydrogenase activity)等生物功能，功能定位在線粒體(mitochondrion)、succinate dehydrogenase complex(線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ、琥珀酸脫氫酶復(fù)合體)等；發(fā)現(xiàn)天麻的預(yù)測(cè)靶標(biāo)與檸檬酸循環(huán)(citrate cycle)、碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)、脂質(zhì)代謝(lipid metabolism)、過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPAR)信號(hào)通路、2-氧代羧酸代謝(2-oxocarboxylic acid metabolism)脂肪酸代謝等生物代謝通路有關(guān)。

2.3天麻“藥物-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)(Hub)分析 通過整合藥理學(xué)平臺(tái)得到40個(gè)頭痛相關(guān)的靶點(diǎn)，并利用蛋白-蛋白相互作用模塊構(gòu)建天麻潛在靶標(biāo)與頭痛靶標(biāo)相互作用關(guān)系，平臺(tái)設(shè)定同時(shí)滿足大于節(jié)點(diǎn)“連接度”“介度”“緊密度”的中位數(shù)為卡值，選取關(guān)鍵核心靶標(biāo)，并進(jìn)行核心靶標(biāo)的GO富集分析、KEGG通路富集分析，根據(jù)連接度值排名前100位的靶點(diǎn)信息繪制的核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)。

圖1 核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

結(jié)果得到核心靶標(biāo)信息118條，其中潛在藥物靶標(biāo)(putative drug target)9條，如GCK、ATP1A1、RPIA、ITPA、YWHAE、CPB1、RCVRN、LY96、PPARG，已知疾病靶標(biāo)(known disease target)27條，如HTR2B、HTR1B、HTR1D、PIK3CA、HTR1A、HTR1F、ADORA2A、HRH4、IMPA1、ADORA1、HTR7、PIK3CB、CALCB等(表1)。

2.4關(guān)鍵靶標(biāo)GO富集分析和KEGG通路富集分析 平臺(tái)對(duì)天麻干預(yù)頭痛的關(guān)鍵靶標(biāo)分析，得到GO富集分析結(jié)果949條和KEGG通路富集分析結(jié)果137條。GO富集分析顯示天麻參與生物功能主要定位在質(zhì)膜(plasma membrane)、細(xì)胞質(zhì)(cytosol)、神經(jīng)遞質(zhì)、樹突等，參與G-蛋白耦聯(lián)5-羥色胺受體活性(G-protein coupled serotonin receptor activity)、血清素受體信號(hào)通路( serotonin receptor signaling pathway)、第二信使環(huán)核苷酸耦聯(lián)的G-蛋白耦聯(lián)受體信號(hào)通路(G-protein coupled receptor signaling pathway，coupled to cyclic nucleotide second messenger)、血清素結(jié)合(serotonin binding)、血小板活化(platelet activation)、肌醇磷酸代謝過程(inositol phosphate metabolic process)、磷脂酶C活性( phospholipase C activity)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子的釋放(release of sequestered calcium ion into cytosol)、磷脂酶C活性的激活(activation of phospholipase C activity)等，見表2；KEGG通路分析預(yù)測(cè)天麻在關(guān)于神經(jīng)系統(tǒng)(nervous system)、炎癥遞質(zhì)調(diào)節(jié)色氨酸通道(inflammatory mediator regulation of TRP channels)、5-羥色胺能神經(jīng)突觸(Serotonergic synapse)、雌激素信號(hào)通路(estrogen signaling pathway)、Calcium signaling pathway(鈣信號(hào)通路)、神經(jīng)營養(yǎng)因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(neurotrophin signaling pathway)、縫隙連接(gap junction)、信號(hào)通路(cGMP - PKG signaling pathway，cGMP PKG)、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)( phosphatidylinositol signaling system)、膽堿能突觸(cholinergic synapse)、碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)、神經(jīng)活性的配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)等主要疾病靶標(biāo)通路，見表3。

表1 天麻治療頭痛核心靶標(biāo)表(排名前20位)

Tab.1CoretargetsofGastrodiarhizomaforthetreatmentofheadache(Top20)

種類核心靶標(biāo)連接度緊密度介度已知疾病靶標(biāo)HTR2B430.606 217 625.898 305 08 潛在藥物靶標(biāo) GCK420.567 961 174.872 881 36已知疾病靶標(biāo)HTR1B320.529 411 760.00E+00已知疾病靶標(biāo)HTR1D320.529 411 760.101 694 92潛在藥物靶標(biāo)ATP1A1310.521.402 542 37已知疾病靶標(biāo)PIK3CA310.522 321435.495 762 71已知疾病靶標(biāo)HTR1A310.527 027 030.00E+00已知疾病靶標(biāo)HTR1F310.527 027 031.398 305 08已知疾病靶標(biāo)ADORA2A300.559 808 613.313 559 32已知疾病靶標(biāo)HRH4280.430 147 063.220 338 98已知疾病靶標(biāo)IMPA1270.455 252 923.436 440 68已知疾病靶標(biāo) ADORA1270.455 252 920.673 728 81已知疾病靶標(biāo) HTR7250.513 157 891.025 423 73已知疾病靶標(biāo)CALCA210.473 684 212.118 644 07其他PLCB2200.517 699 120.419 491 53已知疾病靶標(biāo)PIK3CD190.471 774 192.588 983 05已知疾病靶標(biāo)PIK3CB190.434 944 241.694 915 25其他PLCB3190.508 695 651.326 271 19 已知疾病靶標(biāo) ALCB170.431 734 320.525 423 73

表2 天麻治療頭痛的GO生物功能表(排名前10位)

Tab.2BiologicalfunctionofGastrodiarhizomaforthetreatmentofheadache(Top10)

編號(hào)條目(術(shù)語)P值GO:0004993G-蛋白耦聯(lián)5-羥色胺受體活性(G-protein 1.06E-18 coupled serotonin receptor activity)GO:0007210血清素受體信號(hào)通路(serotonin receptor 1.09E-16 signaling pathway)GO:0007187與環(huán)核苷酸第二信使耦聯(lián)的G-蛋白耦聯(lián)受體3.56E-15 信號(hào)通路(G-protein coupled receptor signaling pathway,coupled to cyclic nucleotide second messenger)GO:0005886質(zhì)膜(plasma membrane)5.97E-15GO:0005829細(xì)胞質(zhì)(cytosol)3.76E-12

表3 天麻治療頭痛的主要通路表(排名前10位)

Tab.3MainpathwaysofGastrodiarhizomaforthetreatmentofheadache(Top10)

編號(hào)條目(術(shù)語)P值#神經(jīng)系統(tǒng)(nervous system)6.78E-20hsa04750炎癥遞質(zhì)調(diào)節(jié)色氨酸通道(inflammatory 2.72E-18 mediator regulation of TRP channels)hsa047265-羥色胺能神經(jīng)突觸(serotonergic synapse)5.97E-17hsa04915雌激素信號(hào)通路(estrogen signaling pathway)1.88E-14hsa04020鈣信號(hào)通路(calcium signaling pathway)7.80E-14

“#”代表大通路

“#” means the systematic pathway

2.5“中藥-成分-關(guān)鍵藥靶-通路”網(wǎng)絡(luò)可視化圖分析 按照核心靶標(biāo)的KEGG通路P值前30位進(jìn)行繪制的“中藥-成分-關(guān)鍵藥靶-通路”網(wǎng)絡(luò)可視化圖(圖2)，可以觀察到天麻的6種化學(xué)成分天麻素(TCMIP105357)、雙(4-羥基苯基)醚-β-D-喃葡萄糖(TCMIP105353)、枸櫞酸(TCMIP100469)、蒼耳苷/β-谷甾醇3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(TCMIP100352)、蔗糖(TCMIP100350)、十六烷酸(TCMIP100276)和6個(gè)潛在的關(guān)鍵靶標(biāo)GCK、ATP1A1、RPIA、YWHAE、LY96、PPARG關(guān)聯(lián)密切，并參與神經(jīng)系統(tǒng)(nervous system)、神經(jīng)營養(yǎng)因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路( neurotrophin signaling pathway)、碳水化合物代謝( carbohydrate metabolism)、胃酸分泌( gastric acid secretion)、細(xì)胞生長與死亡(cell growth and death)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)、循環(huán)系統(tǒng)( circulatory system)、內(nèi)分泌系統(tǒng)(endocrine system)等通路。

3 結(jié)束語

筆者通過整合藥理學(xué)平臺(tái) V1.0預(yù)測(cè)天麻防治頭痛的有效成分及其潛在作用靶點(diǎn)，從整體上探究天麻活性成分與疾病關(guān)鍵靶標(biāo)的密切關(guān)系以及主要的生物功能通路過程。平臺(tái)發(fā)現(xiàn)天麻素、雙(4-羥基苯基)醚-β-D-喃葡萄糖、枸櫞酸、蒼耳苷/β-谷甾醇3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、十六烷酸等成分與頭痛預(yù)測(cè)的核心靶標(biāo)有高度相關(guān)性。天麻富含酚類物質(zhì)和多糖，已證實(shí)天麻素和4-羥基芐基醇等酚類成分都有顯著的神經(jīng)保護(hù)、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化等作用[11-12]。27條“天麻-頭痛”已知靶標(biāo)中HTR2B、HTR1B、HTR1D、PIK3CA等具有很高的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦担珻OROMINAS等[13]證明5-羥色胺受體2B (HTR2B)在有先兆偏頭痛和無先兆偏頭痛疾病均有不同的參與過程； YUCEL等[14]研究發(fā)現(xiàn)偏頭痛患者表現(xiàn)為系統(tǒng)性5-羥色胺濃度降低和腦內(nèi)5-羥色胺合成率的變化，5-HTR2A、5-HTR2C參與誘發(fā)頭痛，5-HTR1A、5-HTR1B、5-HT1D受體能迅速緩解曲坦類藥物導(dǎo)致的偏頭痛和叢集性頭痛；PIK3CA(磷脂酰肌醇3-激酶)是參與細(xì)胞增殖、G蛋白耦聯(lián)受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面的重要基因，參與癌癥基因表達(dá)等，可能與膠質(zhì)神經(jīng)元腫瘤引起的頭痛有關(guān)[15]。9個(gè)關(guān)于頭痛的潛在藥物靶標(biāo)中葡萄糖激酶(glucokinase，GCK)、ATPA1的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦迪鄬?duì)較高，分別排在第2位和第5位，GCK是維持人體葡萄糖體內(nèi)平衡的傳感器[16]，平臺(tái)顯示GCK與Gastrodin、Bis(4-hydroxybenzyl)ether mono-β-D-glucopyranoside、sucrose密切相關(guān)，相關(guān)研究也表明天麻素有顯著的降血糖作用，能調(diào)節(jié)脂代謝紊亂等[17]，推測(cè)天麻素藥理作用與GCK有一定關(guān)系；ATP1A1(鈉/鉀轉(zhuǎn)運(yùn)的堿性磷酸酶亞基α-1)是通過對(duì)Na和K離子通過質(zhì)膜進(jìn)行電化學(xué)梯度建立和維護(hù)的膜蛋白，研究發(fā)現(xiàn)它與高血壓病有關(guān)[18]；RPIA(5-磷酸糖異構(gòu)酶A)也是相對(duì)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦递^高的潛在靶標(biāo)，它主要參與戊糖磷酸途徑，與腦白質(zhì)病、周圍神經(jīng)疾病等有關(guān)[19]，此外還有YWHAE、LY96、PPARG等拓?fù)渲迪鄬?duì)較小的潛在藥物靶標(biāo)。

綠色：中藥；紫色：成分；藍(lán)色：關(guān)鍵靶標(biāo)；紅色：通路

生物活性成分和疾病靶標(biāo)的鑒定與研究是中藥研究的一個(gè)重要領(lǐng)域[20]，本研究基于中藥整合藥理學(xué)平臺(tái)有效證實(shí)天麻活性化學(xué)成分，并預(yù)測(cè)出天麻防治頭痛的潛在藥物靶標(biāo)及作用機(jī)制，但只考慮中藥成分和疾病靶標(biāo)與目標(biāo)蛋白之間的相互作用，還不足以解釋中醫(yī)藥對(duì)疾病基因表達(dá)更深層面的影響，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明和探究。