7-甲氧基-4’-羥基異黃酮促進大鼠成骨細胞成骨性分化的作用機制*

宋明甲，文益民，吳曉燕，柴曉亮，周建

(中國人民解放軍聯勤保障部隊九四○醫院1.脊柱外科；2.骨科研究所，蘭州 730050)

大豆苷元和黃酮可提高骨密度和增加骨胳礦鹽的含量，改善骨胳微觀結構[1]，但其作用機制尚不清楚。有人通過結構類推，黃酮類化合物具有類似于雌激素樣的結構，所以異黃酮可能通過雌激素信號機制促進骨形成。系列研究表明，大豆異黃酮能治療去卵巢大鼠模型的骨質疏松癥，減少去卵巢造成的骨丟失，且對生殖器官無雌激素樣作用[2-3]，因此異黃酮通過雌激素信號途徑調節骨形成并不是其主要作用機制。前期研究表明，異黃酮通過提高一氧化氮(NO)含量發揮改善心血管疾病作用[4]。因此，筆者通過體外培養成骨細胞觀察研究黃豆苷元雜質7-甲氧基-4’-羥基異黃酮(7-methoxy-4’-hydroxyisoflavone，MHIF)對NO/cGMP/sGC信號通路的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級大鼠，出生2 d內，購于甘肅中醫藥大學動物實驗中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(甘) 2016-0006。

1.2試劑 7-甲氧基-4’-羥基異黃酮(MHIF，中國食品藥品檢定研究院，批號：100348-201102，含量：100%)，胎牛血清(蘭州榮曄生物生物公司，批號：RF-32-01)；達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM，美國Gibco公司，批號：11054020)；β-磷酸甘油鈉、維生素C(批號：A4403)、地塞米松(批號：D4902)、青霉素(批號：M7292)、鏈霉素(批號：V900929)，均購于美國Sigma公司；Ⅱ型膠原酶(Invitrogen公司，批號：17100-017)；sGC一抗(美國abcam公司，批號：ab155651)；PKG-1一抗(cell signaling公司，批號：#3248)；辣根過氧化酶標記二抗(北京Bioword有限公司，批號：BS10043)；BCA蛋白定量試劑盒(索萊寶生物公司，批號：F8060)；骨鈣素測定試劑盒(南京建成生物工程公司，批號：H152)，一氧化氮(NO，南京建成生物工程公司，批號：A012-1)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)測定試劑盒(南京建成生物工程公司，批號：A059-2)；一氧化氮合成酶阻斷劑N-單甲基-L- 精氨酸(N-monomethyl-L-arginine，L-NMA，批號：475886)和可溶性的腺苷酸環化酶(ODQ，批號：495320)購于美國Sigma公司。

1.3儀器 酶標儀(BIoTek公司，型號：EPOCH)；離心機(湖南湘儀公司，型號：Primo R)。

1.4大鼠原代成骨細胞培養 大鼠原代顱骨成骨細胞[4]，無菌條件下，取出生2 d內SPF級大鼠顱骨，剔除骨膜及軟組織，將骨片剪成碎片，用0.25%胰蛋白酶于37 ℃水浴酶解2次，每次10 min，棄消化液。0.1%Ⅱ型膠原酶于37 ℃水浴連續消化4次，第1次10 min消化結束后棄掉消化液，以后每次水浴消化20 min，結束后收集消化液，加入含有10%胎牛血清DMEM終止消化，收集液200×g離心10 min，棄上清液，用含10%胎牛血清DMEM懸浮細胞沉淀。以3×104·mL-1的濃度接種培養中，37 ℃、5%二氧化碳(CO2)、飽和濕度條件下培養，每隔3 d換液一次，待細胞長至80%融合時傳代培養。

1.5成骨細胞的藥物處理 待成骨細胞傳代培養融合生長達到80%～90%時，使用不同濃度 (10-4，10-5，10-6，10-7和10-8mol·L-1) MHIF對成骨細胞進行處理，其中對照組補加與藥物組等體積藥物溶劑(DMSO)，藥物濃度參考前期文獻報道黃酮類化合物[4]，使用不同濃度MHIF對成骨細胞進行處理后，通過測定ALP活性找到最合適濃度的藥物濃度。

1.6成骨細胞的阻斷劑處理 待成骨細胞傳代培養融合生長達到80%～90%時，加入100 μmoL·L-1的L-NMA預處理成細胞，然后對成骨細胞進行隨機分組，使用10-6mol·L-1MHIF進行處理檢測各項結果。

1.6.1堿性磷酸酶活性的測定 MHIF處理成骨細胞后，使用堿性磷酸酶試劑盒測定其活性。具體操作參見說明書，按照1：1的比例分別加入基質液1和基質液2，然后37 ℃水浴15 min后加入顯色劑，避光混勻后在507 nm波長測定吸光度(A)值，然后依據說明書換算成金氏單位。

1.6.2骨鈣素含量測定 MHIF處理成骨細胞后，測定培養液中骨鈣素含量。收集血清，室溫放置5 min 后，400×g離心10 min，檢測骨形成指標骨鈣素含量。嚴格按照EIA kit試劑盒說明書測定，測定結束后，嚴格按照測定A值和標準品濃度制作標準曲線。

1.6.3NO含量檢測 MHIF處理后，每組取培養液 500 μL，測定培養液中硝酸鹽含量，以硝酸鹽含量來反映一氧化氮(NO)生成量。具體操作按照硝酸還原酶法一氧化氮試劑盒說明書。將各樣品加至96孔板中，紫外分光光度計上測定波長550 nm處A值，利用NO含量計算公式計算出樣本NO含量。

1.6.4cGMP含量檢測 MHIF處理后，用4 ℃預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗培養細胞3次，每皿細胞加入0.25%胰蛋白酶1.5 mL收集細胞，4 ℃、200×g離心10 min，棄上清液，加PBS 200μL渦旋震蕩混勻，沸水浴10 min。冷卻后，5000×g離心10 min，采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)法定量檢測環磷酸鳥苷(cGMP)。紫外分光光度計測定450 nm波長處A值，根據標準品的濃度及對應的A值計算出濃度。

1.6.5蛋白電泳 MHIF處理成骨細胞后，開始提取總蛋白，取出培養成骨細胞后PBS漂洗2次，每一個60 mm皿中加入蛋白裂解液300 μL，放免沉淀檢測法(radio immunoprecipitation assay，RIPA)，低溫靜置裂解30 min，收集裂解液，5000×g離心離心30 min，收集上清液，取出20 μL，BCA法測定蛋白濃度，加上樣緩沖液，煮沸變性10 min，-20 ℃冰箱保存備用。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)檢測蛋白電泳，按照每孔總蛋白上樣量為20 μg，根據BCA定量蛋白濃度計算上樣體積，在電泳結束后，將SDS上蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，轉膜條件：電流280 mA轉膜60～80 min，轉膜結束后5%脫脂奶粉封閉2 h，加入sGC和PKG一抗(1：1000稀釋)，4 ℃孵育過夜，結束后搖床振蕩洗膜3次，每次10 min，加入二抗37 ℃孵育1.5 h，洗膜3次，每次10 min，暗室加入電致化學發光(electrochemiluminescence，ECL)發光液檢測蛋白的表達情況，用X射線片記錄結果，IPP6.0掃描蛋白條帶灰度。

2 結果

2.1MHIF對成骨細胞作用濃度篩選 結果見圖1。10-6mol·L-1MHIF為促進成骨細胞最合適濃度。實驗數據顯示，10-4～10-6mol·L-1MHIF處理成骨細胞，隨著藥物濃度降低，ALP活性逐漸升高，其中10-6mol·L-1組ALP活性最高為71.23 U·g-1，然而，MHIF在10-6～10-8mol·L-1，隨著濃度降低，ALP活性也逐漸降低。

2.2MHIF對成骨細胞骨鈣素表達的影響 結果見圖2。實驗結果顯示，骨鈣素的表達與MHIF具有濃度依賴性，10-6mol·L-1MHIF組骨鈣素含量最高，為633 ng·mL-1。

2.3L-NMA對MHIF提高ALP活性的影響 實驗結果顯示，MHIF組ALP活性顯著高于對照組(P<0.01)，MHIF組ALP活性顯著高于L-NMA+MHIF組(P<0.05)，其他組間比較差異無統計學意義，見圖3。

2.4L-NMA對MHIF提高成骨細胞骨鈣素含量影響 實驗結果顯示，MHIF組骨鈣素含量高于對照組(P<0.01)，MHIF組骨鈣素含量顯著高于L-NMA+MHIF組(P<0.01)，其他組間比較差異無統計學意義。見圖4。

與對照組比較，*1P<0.01；與MHIF組比較，*2P<0.05

Compared with control group,*1P<0.01; Compared with MHIF group,*2P<0.05

Fig.3EffectofL-NMAtreatmentonALPactivityenhancementbyMHIF

與對照組比較，*1P<0.01；與MHIF組比較，*2P<0.01

Compared with control group,*1P<0.01; Compared with MHIF group,*2P<0.01

2.5L-NMA對MHIF提高成骨細胞NO濃度的影響 實驗結果顯示，MHIF組NO含量高于對照組(P<0.01)，MHIF組NO含量顯著高于L-NMA+MHIF組(P<0.05)，其他組間比較差異無統計學意義。見圖5。

2.6L-NMA對MHIF提高成骨細胞cGMP濃度的影響 實驗結果顯示，MHIF組cGMP含量高于對照組(P<0.01)，MHIF組cGMP含量顯著高于L-NMA+MHIF組(P<0.05)，其他組間比較差異無統計學意義。見圖6。

2.7對成骨細胞sGC和PKG蛋白表達影響 結果見圖7。L-NMA處理成骨細胞后，MHIF提高sGC和PKG蛋白的表達水平受到抑制。

與對照組比較，*1P<0.01；與MHIF組比較，*2P<0.05

Compared with control group,*1P<0.01; Compared with MHIF group,*2P<0.05

Fig.5EffectofL-NMAtreatmentonNOenhancementbyMHIF

與對照組比較，*1P<0.01；與MHIF組比較，與*2P<0.05

Compared with control group,*1P<0.01; Compared with MHIF group,*2P<0.05

Fig.6EffectofL-NMAtreatmentoncGMPenhance-mentbyMHIF

圖7 MHIF對體外培養成骨細胞內sGC和PKG蛋白表達水平的影響

Fig.7EffectofMHIFontheproteinexpressionofsGCandPKGinosteoblastsculturedinvitro

3 討論

近年來，研究發現黃酮類化合物具有重要的藥理活性，尤其是對骨代謝調節作用，但具體機制尚未完全清楚。筆者在本研究首先研究不同濃度MHIF對體外培養大鼠顱骨成骨細胞的骨形成活性的影響，1×10-6mol·L-1MHIF能顯著提高成骨細胞中ALP活性和骨鈣素含量，并且存在一定劑量依賴性。目前研究表明，通過提高血管內皮細胞一氧化氮改善心腦血管疾病[5]，本實驗研究MHIF促進體外培養成骨細胞成骨性分化過程中是否激活NO信號通路。

成骨細胞在骨代謝過程中扮演著骨形成的角色，如果能有效促進成骨細胞成骨性分化，那么就能促進骨形成。因此，本研究通過體外培養大鼠顱骨成骨細胞在不同的藥物干預后其成骨性分化的相關指標，堿性磷酸酶和骨鈣素是成骨細胞成骨性分化的標志性指標，因此首先從ALP活性和骨鈣素含量水平[6]，篩選最佳促進成骨細胞成骨性分化的的最適濃度為10-6mol·L-1，同時實驗結果表明促進體外培養成骨細胞分化過程具有劑量依賴性，黃酮類化合物調節骨骼代謝存在劑量的依賴性。

NO參與調控多種生理過程，包括骨重建[7-8]。NO可結合到可溶性鳥苷酸環化酶(soluble guanylate cy-clase，sGC)的血紅素基團上，提高該酶活性[9]，由此引起cGMP水平升高，從而導致 cGMP 依賴性蛋白激酶級聯激活，以及進一步激活下游信號通路發揮生理活性作用。體外研究表明，由成骨細胞自身產生的少量 NO，可能是成骨細胞內生長因子產生的調節劑[10-12]。NO 供體內 NO 的緩慢釋放誘導體外成骨細胞的生長和分化[10]。實驗結果顯示，MHIF促進體外培養成骨細胞成熟與礦化過程中激活NO信號途徑。使用L-NMA預處理成骨細胞后發現，MHIF促進成骨細胞中ALP活性和骨鈣素含量的能力受到抑制，因此初步證明MHIF促進體外培養成骨細胞分化過程中需要激活一氧化氮合酶參與其中。其次，本研究進一步觀察發現，一氧化氮合酶活性被抑制后，MHIF提高成骨細胞NO和cGMP含量均受到抑制，以成骨細胞中sGC和PKG蛋白的表達水平也受到抑制，因此進一步證明MHIF在促進成骨細胞骨形成過程中通過NO/cGMP/sGC信號過程發揮作用。

成骨細胞在骨形成過程中發揮重要作用，因此，本實驗應用成骨細胞研究MHIF對體外培養成骨細胞的藥理活性，以及其促進成骨性分化的分子機制，實驗結果表明MHIF在促進體外培養成骨細胞成骨性分化過程中激活NO信號通路，實驗因此推測這個機制為MHIF調節骨代謝可能機制之一，此實驗結果為異黃酮類化合物的藥物促進活性的機制奠定基礎，下一步有待從動物實驗水平證明其活性和作用機制。