新型載體羅漢果苷V對紫杉醇的增溶作用*

王杏利，王爽，張雷，羅玉琴，韋銘旻，吳春勇，張峻穎

(1.中國藥科大學中藥制藥系，南京 211198；2.廣東食品藥品監督管理局認證審評中心，廣州 510080；3.山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 250101；4.中國藥科大學藥物分析系，南京 210009)

口服給藥簡單，方便，患者依從性高，是藥物遞送的最優選途徑。但目前超過40%市售藥物、60%研發中藥物都存在難溶性問題。得益于載體輔料的開發應用，改善疏水性藥物的溶解性和生物利用度已有多種方法，如：使用磷脂復合物、生物相容性聚合物、固體分散體、脂質體或膠束等[1-4]。但目前滿足上述方法要求、符合中藥成分特性的輔料尤為缺乏。本課題組前期發現一些糖基化苷類化合物在水性環境中，能夠形成與表面活性劑相似的結構，可作為固體分散體的載體，實現難溶性藥物的高效增溶[5-7]。羅漢果甜苷是羅漢果的甜味成分。植物含量較高且水溶性好，目前已經有純度98%以上成品用作食品添加劑，其甜度為蔗糖的300倍。羅漢果苷V是羅漢果甜苷的主要成分，是一種天然小分子化合物，由親水性葡萄糖基和疏水性三萜類兩部分組成，與已報道的糖苷類增溶載體結構相似，故選其為載體，以研究其對難溶性藥物的增溶效果。羅漢果苷V甜度高，熱穩定性好，色澤淺，易于使用，不受pH值(pH值在2～10)的影響。它在中國、美國、日本等一些國家作為非營養性天然甜味劑而聞名[8]。同時，含葡基輔料還可能通過與葡萄糖轉運體1(glucose transporter 1，GLUT1)結合實現跨越血-腦屏障，進而實現對目標藥物的腦靶向轉運[9]。

紫杉醇(paclitaxel，PTX)是一種從短葉紅豆杉(taxus brevifolia)莖皮中分離出來的復雜二萜類天然產物[10]，由于能夠與微管蛋白結合誘導細胞死亡并影響微管動力學[11]，紫杉醇在治療乳腺癌、卵巢癌和非小細胞肺癌方面表現出優異的抗腫瘤活性[12]。然而紫杉醇高度親脂，水中溶解度低，研究報道顯示其在小鼠中的生物利用度<3.6%[13]，這一缺陷大大限制紫杉醇的臨床應用。已上市產品紫杉醇注射液(Taxol?，商品名：泰素)使用乙醇和聚氧乙烯蓖麻油(50：50)的共溶劑系統來增加其溶解度，由于聚氧乙烯蓖麻油存在顯著的毒副作用，如神經毒性、腎毒性、變態反應等[14]，給患者的生命健康帶來極大的危害。所以，新型載體或輔料的發掘，可為紫杉醇的臨床制劑進一步開發提供幫助。

因此，筆者以羅漢果苷V為載體，以紫杉醇為模型藥，采用溶劑法制備紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體?？疾炱滹柡腿芙舛群腕w外溶出特征，通過差示熱掃描法(differential scanning calorimetry,DSC)考察紫杉醇在固體分散體中的物理存在形態。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-2010CHT液相色譜儀(含高壓泵、柱溫箱、自動進樣器、紫外檢測器、LC solution色譜工作站，日本島津公司)；KQ-250DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BT125D電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司，感量：0.01 mg)；XW-80A旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；旋轉蒸發裝置(含N-1100型旋轉蒸發儀、OSB-2100型油浴鍋，上海愛朗儀器有限公司)；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；DKZ系列電熱恒溫振蕩水槽(上海一恒科技有限公司)；2XZ-2型旋片式真空泵(臨海市永昊真空設備有限公司)；差示掃描量熱儀NETZSCH DSC 204(NETZSCH GERAETEBAU GmbH)等。

1.2試藥 紫杉醇對照品(阿拉丁，含量：99%，批號：E1822047)；羅漢果苷V(成都普瑞法科技開發有限公司，含量：98%，批號：PRF8093001)；去離子水；乙腈為色譜純；其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1紫杉醇-羅漢果苷V物理混合物的制備 取紫杉醇適量，按1：5，1：10，1：15，1：20(W/W)添加相應量的羅漢果苷V，置于研缽中研細，混勻，置干燥器中備用。

2.2紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體的制備 采用溶劑法制備紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體，按1：20(W/W)稱取適量紫杉醇和羅漢果苷V，加入適量的80%乙醇，常溫下50 Hz超聲30 min，置于50 ℃水浴鍋中進行減壓濃縮干燥60 min，即可得到固體分散體。得到固體狀固體分散體，用研缽研磨均勻，置干燥器中備用。

2.3高效液相色譜(HPLC)測定紫杉醇

2.3.1色譜條件 色譜柱：Inertsil?ODS-3(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；檢測波長：227 nm； 流速：1 mL·min-1；流動相：乙腈-水(65：35)。

2.3.2紫杉醇對照品溶液的配制 精密稱定紫杉醇10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加入乙腈5 mL，超聲使其溶解，用乙腈定容，配制得濃度約為1 mg·mL-1紫杉醇對照品溶液。

2.3.3羅漢果苷V對照品溶液的配制 精密稱定羅漢果苷V 10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加入乙腈5 mL，超聲使其溶解，用乙腈定容，配制得濃度約為1 mg·mL-1羅漢果苷V對照品溶液。

2.3.4紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體溶液的配制 精密稱定紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加入乙腈5 mL，超聲使其溶解，用乙腈定容，配制得濃度約為1 mg·mL-1紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體溶液。

2.3.5專屬性實驗 分別取空白溶劑、羅漢果苷V對照品溶液、紫杉醇對照品溶液和紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體溶液，按“2.3.1”條件，進行HPLC分析，紫杉醇典型色譜圖見圖1。結果表明，在本色譜條件下，紫杉醇峰形良好，保留時間約為6.8 min，空白溶劑和羅漢果苷V對主峰的測定無干擾。

2.3.6檢測限及定量限 取“2.3.2”項制備的紫杉醇對照品溶液，按一定比例稀釋，得到一系列濃度溶液，進行HPLC分析，紫杉醇檢測限(S/N=3)和定量限(S/N=10)分別為20 ng·mL-1和50 ng·mL-1(n=5)。

2.3.7線性關系考察 取“2.3.2”項制備的紫杉醇對照品溶液，按一定比例稀釋，得到濃度分別為0.05，0.1，0.2，1，5，10，25，50 μg·mL-1的標準液，按“2.3.1”項條件進行HPLC分析，以紫杉醇峰面積(A)為縱坐標，紫杉醇濃度(C，μg·mL-1)為橫坐標進行線性回歸，結果表明紫杉醇在0.05～50 μg·mL-1內線性關系良好，回歸方程為：A=44 827C+387.46，R2=1.000 0。

A.空白溶劑；B.羅漢果苷V對照品溶液；C.紫杉醇對照品；D.紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體溶液；1.羅漢果苷V；2.紫杉醇

圖1 4種溶液的HPLC圖譜

1.blank solution；B.mogroside-V reference solution；C.paclitaxel reference solution；D.paclitaxel-mogroside-V SD solution；1.mogroside-V； 2.paclitaxel

Fig.1HPLCchromatogramsoffourkindsofsolution

2.3.8精密度實驗 精密量取“2.3.2”項制備紫杉醇對照品溶液0.5 mL，置于100 mL量瓶中，加流動相定容，得到5 μg·mL-1紫杉醇溶液。按“2.3.1”項方法重復測定6次，結果峰面積穩定，RSD為0.8%，表明儀器精密度良好。

2.3.9重復性實驗 取紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體(1：20)約20 mg，共6份，精密稱定。置于10 mL量瓶中，加適量乙腈溶解并定容。精密量取0.5 mL，置10 mL量瓶，加流動相定容。配制得相當于紫杉醇含量5 μg·mL-1溶液。按“2.3.1”項方法測定，計算6份樣品中的紫杉醇含量。測定6份固體分散體中紫杉醇的含量分別為4.3%，4.2%，4.3%，4.4%，4.4%，4.3%，RSD為1.3%，表明該方法重復性良好。

2.3.10穩定性實驗 取“2.3.9”項下含紫杉醇5 μg·mL-1的紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體溶液，室溫下放置0，2，4，6 h，按“2.3.1”項方法分別測定，紫杉醇峰面積RSD為0.06%，表明紫杉醇溶液在室溫下6 h內穩定。

2.3.11加樣回收率實驗 參考文獻[15]方法，分別精密稱取紫杉醇適量，按處方比例(1：20)添加羅漢果苷V，分別制成高、中、低濃度溶液各3份，按“2.3.1”項方法測定。分析結果見表1，加樣回收率在97.9%～101.5%，方法準確度良好。

2.4紫杉醇與羅漢果苷V投藥比例篩選 根據物理混合物飽和溶解度測定。取紫杉醇-羅漢果苷V不同比例的物理混合物(相當于紫杉醇1 mg)，置于2 mL EP管中，加水0.5 mL，置于恒溫振蕩水浴鍋中，37 ℃振搖飽和24 h，后取上清液，用孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液按“2.3.1”項方法測定紫杉醇濃度。結果如圖2。結果顯示隨著羅漢果苷V加入量的增加，紫杉醇的增溶倍數增加，故最終選取紫杉醇-羅漢果苷V 1：20(W/W) 為處方制備固體分散體。

表1 紫杉醇加樣回收率實驗結果

Tab.1Resultsofrecoverytestofpaclitaxel

濃度水平加入量測得量mg回收率平均回收率RSD%高12.0412.12100.712.0212.20101.5101.20.4612.0112.19101.5中10.0110.07100.610.0210.04100.2100.40.2110.0110.06100.5低8.038.04100.18.027.8597.999.21.168.017.9899.6

圖2 紫杉醇/羅漢果苷Ⅴ物理混合物的增溶倍數變化曲線

Fig.2Solubilizationfoldcurveofpaclitaxel-Mog-Vphysicalmixture

2.5固體分散體飽和溶解度實驗 分別取紫杉醇和紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體(相當于紫杉醇1 mg)，置于2 mL EP管中，加水0.5 mL，置于恒溫振蕩水浴鍋中，37 ℃振搖飽和24 h，用孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液按“2.3.1”項方法測定紫杉醇濃度。結果顯示紫杉醇的飽和溶解度約為0.1 μg·mL-1，紫杉醇/羅漢果苷V固體分散體的飽和溶解度約為37.5 μg·mL-1。與紫杉醇比較，固體分散體的飽和溶解度增加約375倍，表明羅漢果苷V明顯增加紫杉醇的溶解度。

2.6DSC法分析 分別取紫杉醇、羅漢果苷V、紫杉醇與羅漢果苷V的物理混合物(1：20)、紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體適量，置于鋁制坩堝內，蓋上蓋子，密封。測試條件為：以空鋁坩堝為參比，升溫速率：10 ℃·min-1，掃描范圍：40～300 ℃，結果見圖3。由DSC圖可知，紫杉醇和羅漢果苷V分別在214和178.8 ℃處各有一吸熱峰。紫杉醇和羅漢果苷V物理混合物的DSC圖為兩者圖譜的疊加，分別在177和210 ℃處有吸熱峰。而固體分散體的DSC圖中，紫杉醇的吸熱峰消失，僅在164.6 ℃處出現一個微小的吸熱峰，表明以羅漢果苷V為載體，紫杉醇在固體分散體的制備過程中，由晶體轉變為無定形或極其微小的晶體。

圖3 羅漢果苷V(A)、固體分散體(B)、物理混合物(C)、紫杉醇(D) DSC圖譜

Fig.3DSCthermogramsofmogroside-V(A)，SD(B)，PM(C)，andpurepaclitaxel(D)

2.7體外溶出度實驗 參照文獻[16]方法，以恒溫振蕩水浴鍋為溶出裝置，以pH值 6.8磷酸鹽溶液(含0.2%聚山梨酯80)為溶出介質，每個溶出杯加入溶出介質100 mL，振蕩頻率50 r·min-1，溫度為(37±0.5) ℃。稱取等價于主藥約2 mg的紫杉醇、物理混合物(1：20)、固體分散體分別加入溶出介質中，于5，10，20，30，60，120 min定時定位取樣1 mL，經孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液。同時向溶出杯中補加新鮮介質1 mL。取出的樣品立即按“2.3.1”項方法測定紫杉醇濃度，重復3次。結果見圖4。結果顯示紫杉醇在120 min時累積溶出度為12%，紫杉醇-羅漢果苷V(1：20)物理混合物累積溶出度在120 min達到36.3%。紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體在5 min時溶出度就達到42.2%，120 min時累積溶出度達到83.9%。與紫杉醇比較，固體分散體和物理混合物的溶出速率和累積溶出度都有明顯的提高，說明羅漢果苷V能夠顯著增加難溶性藥物紫杉醇的體外溶出。

累積溶出量(%)=(溶出的總物質量/投入量)×100%

溶出的總物質量=當前取樣點介質濃度×介質體積+(之前取樣點介質濃度×取樣量)

圖4 紫杉醇、物理混合物和固體分散體的體外溶出曲線

Fig.4Dissolutioncurvesofpaclitaxel,PMandSD

3 討論

筆者在本研究以食品添加劑羅漢果苷Ⅴ為固體分散體的載體，考察不同投藥比例對紫杉醇增溶效果的影響。以藥物增溶倍數為指標，篩選出最佳的固體分散體投藥比例為1：20(W/W)。同時，本研究建立了靈敏度高、準確度好、檢測范圍廣的HPLC法，用于測定制劑中紫杉醇的含量。另外，通過DSC分析法驗證紫杉醇在固體分散體中以無定形或微小晶體形式存在，顯示出該制劑中紫杉醇的增溶機制是改變其難溶性的晶體結構及降低晶體的大小。飽和溶解度和體外溶出的實驗結果表明，以羅漢果苷V為載體，能有效提高難溶性藥物紫杉醇的溶解度，進而改善其溶出速率和累積溶出度。

本研究的固體分散體處方簡單、制備工藝簡便，不僅顯著提高紫杉醇的飽和溶解度，還有效改善其體外溶出性能。羅漢果苷V作為食品添加劑，安全、無毒。該研究結果表明羅漢果苷V有望成為新型載體輔料，在難溶性藥物的制劑開發中具有極大應用價值。