基于生物信息分析學方法篩選多發性骨髓瘤差異表達基因

何思羽，王清

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州 646000)

多發性骨髓瘤(MM)是一種起源于漿細胞異常增生的單克隆惡性腫瘤性疾病，常伴有不同程度的骨損害，表現為骨骼破壞、頑固性疼痛、病理性骨折、高鈣血癥及脊髓受壓等，又稱之為骨髓瘤骨病(MBD)，是第二常見的血液系統惡性腫瘤[1]。近年來，隨著蛋白酶體抑制劑(PIS)、免疫調節藥物(IMID)的應用及自體干細胞移植(ASCT)的進行極大改善了MM患者的預后，然而當前仍無法完全治愈，預計2018年在美國MM的死亡可能會達到1 2000人[1，2]。研究[3,4]發現，分子細胞遺傳學異常與克隆異質性和克隆進化關系密切，在MM發病中發揮著重要作用。高危細胞遺傳學異常患者更容易出現克隆異質性和克隆進化現象，與疾病的發展和預后密切相關，故針對MM的臨床和生物學上的異質性，從分子水平探索其治病機制，開發精準治療方案，進一步改善患者預后，提高生命質量具有重要意義。高通量信息技術的發展為疾病基因改變的研究帶來了巨大便利，利用生物信息分析學方法有助于探索分子改變與疾病預后的關系，快速挖掘有效的分子靶標，進一步實現腫瘤精準治療的研究方向[5，6]。本研究采用生物信息分析學方法從GEO數據庫下載并整理有關MM基因微陣列數據，獲得腫瘤發生發展過程中顯著差異表達基因(DEGs)，從而篩選出可能參與MM發生發展的基因，旨在為探索MM的發病機制、診斷及治療提供基礎。

1 資料與方法

1.1 資料搜集 利用NCBI中基因芯片公共數據庫(GEO)芯片數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.go)，以“multiple myeloma，Homo”為關鍵詞搜索目標芯片。經篩選后，采用由Liu等提交以GPL10558 Illumina HumanHT-12 V4.0 expression beadchip為平臺的基因芯片GSE113295。該芯片共18例樣本，由12例完全緩解MM骨髓樣本和6例正常樣本構成。

1.2 MM的差異表達基因分析 應用GEO數據庫基于R語言中GEOquery[7]和limma[8]程序包的在線分析工具GEO2 R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)以P<0.05、|logFC|>1.5為條件篩選出GSE113295芯片的差異基因。

1.3 MM的差異表達基因基因功能富集分析及調控通路分析 使用DAVID6.8(The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)在線分析工具(https://david.ncifcrf.gov/)以P<0.05為條件篩選出的差異基因進行GO功能注釋和KEGG信號通路富集分析。GO是識別并注釋高通量基因組或轉錄組數據的生物學特性的常用分析方法，可按照生物途徑分為生物學過程(BP)、分子功能(MF)以及細胞組成(CC)。KEGG通路富集分析則顯示差異基因富集的信號通路。

1.4 MM的差異表達基因所調控蛋白互作網絡與關鍵基因分析 使用蛋白互作數據庫(STRING，http://string-db.org/)，分析MM骨髓樣本和正常樣本差異表達基因所編碼蛋白的相互作用關系，以互作評分combination score>0.4為條件構建蛋白質互作網絡(PPI)。然后將STRING中得到的蛋白互作網絡數據導入Cytoscape軟件，使用網絡分析cytoHubba插件計算網絡中節點的點度中心性(DC)、中介中心性(BC)以及接近中心性(CC)，取這3個參數前10名的基因，并取交集。

2 結果

2.1 MM的差異表達基因的篩選結果 按照篩選條件，在GSE113295基因芯片中MM樣本和正常樣本的差異表達基因共1 380個，其中上調1 274個，下調6個。按照差異倍數|logFC|大小排序，前三個上調基因為羥基17-β脫氫酶13(HSD17B13)、UNC-5家族c-終端(UNC5CL)、GLI家族鋅指蛋白1(GLI1)，前三個下調基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、MLC成員肌球蛋白調節輕鏈5(MYL5 )、脂連蛋白(ADIPOQ)。

2.2 MM的差異表達基因GO功能和調控通路分析結果 MM的差異表達基因GO功能在生物學層面上主要介導免疫反應、細胞通訊、細胞黏附、信號轉導過程；在細胞組分層面上主要參與細胞質膜組成、整合及胞外間隙的調控；在分子功能層面主要富集于G蛋白偶聯受體活性、細胞黏附分子活性、結構因子活性、細胞因子活性。KEGG信號通路分析顯示，差異表達基因主要調控神經活性配體—受體相互作用、細胞黏附分子(CAMs)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路(詳見表1)。

表1 在生物學過程、細胞組分、分子功能層面發揮不同功能及調控不同信號通路的差異表達基因

注：基因數量超過20個者只列舉20個基因名稱。

2.3 MM的差異表達關鍵基因的篩選結果 以MM差異表達基因構建蛋白質相互作用網絡，除去孤立無互作的蛋白節點，篩選出230個具有相互作用關系的蛋白質，構成了包含有507個互作邊關系的復雜網絡。在復雜的蛋白互作網絡中應用cytoHubba插件按照DC、BC以及CC的大小排序，集算出排名前10的中心節點。對這三個參數得出的結果取交集，從而挖掘其中7個關鍵基因全長重組蛋白(BUB1B)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、酪氨酸激酶(FYN)、白介素6(IL-6)、肌醇1，4，5-三磷酸3-激酶B(ITPKB)、zeste同源物2(ZH2)，更有可能參與MM的發生發展，為進一步探索MM的發病機制，發現治療MM的生物靶點提供基礎。

3 討論

MM是一種無法治愈的惡性克隆性漿細胞腫瘤，有嚴重的骨痛、病理性骨折、椎體壓縮性骨折等骨相關事件，甚至導致患者反復骨折[9]，多發于老年，在并發骨質疏松癥的情況下，易被漏診[10,11]，嚴重影響患者的生命質量。由此，進一步尋找有助于腫瘤快速診斷和治療的分子靶標迫在眉睫。在本研究中，我們使用了GEO2R在線工具分析了GEO中的芯片數據GSE113295，包含了12例完全緩解MM樣本和6例正常樣本，得到了1 380個的差異基因。通過DAVID對DGEs進行GO功能注釋和KEGG信號通路分析，發現差異基因主要參與了化學突觸傳遞、ERK 1和ERK 2級聯的正調節、酶活性的正調節、鈣離子結合、延遲整流鉀通道活性等；主要由神經活性配體-受體相互作用、PPAR信號通路、細胞黏附分子、脂肪酸合成等通路介導。本研究結果驗證了Saltarella等[12]的結論，血漿水平里與化學突觸傳遞相關的細胞因子和血管生成因子FGF-2、HGF、VEGF和PDGF-β水平對治療反應有預測意義，有助于描述不同的危險組對治療結果和療效的影響；FGF-2與MM的發生發展密切相關[13,14]。鈣離子結合信號通路也是介導MM發生的關鍵病因之一，研究發現非選擇性陽離子通道瞬時受體電位香草酸(TRPV2)可通過鈣依賴磷酸酶NFAT信號通路調節MM中破骨細胞分化，為MM治療的策略提供新的思路。ERK 1和ERK 2級聯的正調節是腫瘤發生發展中的經典通路之一，研究發現磷酸化細胞外信號調節激酶(ERK1/2)的高表達提示MM預后不良[15]；B-Raf V600E抑制劑Rafoxanide通過增強DNA損傷反應和抑制p38 MAPK通路，引發MM細胞凋亡和細胞周期停滯[16]；敲除活化C激酶1受體基因同樣可以通過激活P-P38和P-ERK在MAPK/ERK信號通路減少MM細胞的增殖[17]。

運用蛋白互作數據庫STRING以及Cytoscape軟件分析DGEs，獲得7個關鍵基因BUB1B、PPARG、MAPK14、FYN、IL6、ITPKB、ZH2。BUB1B基因通過CDC20/CCNB軸促進MM細胞增殖，對于高風險MM患者，可能成為MM治療的潛在靶點[18]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)多態性與MM患者的頜骨唑來膦酸相關性骨壞死(BRONJ)相關[19]；PPARG中SNP的存在可能與早期BRONJ的風險增加有關[20]。IL-6作為破骨細胞分化調節劑，與祖細胞結合時促進破骨細胞生成，過度豐富時又導致過度的破骨細胞活性和骨質溶解，與MM的發生發展密切相關[21]。LYN基因為src家族激酶成員是IL6信號通路的關鍵介質，可能成為治療MM的關鍵靶點[22]。尚未發現肌醇-1，4，5-三磷酸3-激酶-B(ITPKB)、zeste同源物2(ZH2)基因在MM發生發展中有明確的相關性。但是，在結腸癌組織和鄰近部分中同樣檢測到ITPKB的差異表達，并且發現miR-410可通過抑制ITPKB基因表達促進腫瘤細胞增殖并減少細胞凋亡[23]；MicroRNA-31通過下調ZH2基因的表達來觸發G2/M細胞周期停滯，增強化學敏感性并抑制人胃癌細胞的遷移和侵襲[24]。為探索MM的發生發展，尋找新的作用靶點提供了新的思路。

總之，利用生物信息分析學方法篩選出MM的關鍵差異表達基因，一方面通過GO功能注釋、KEGG信號通路驗證了多個相關實驗結果，為今后實驗奠定了牢固的理論基礎，另一方面篩選出BUB1B、PPARG、MAPK14、FYN、IL6、ITPKB、ZH2共7個關鍵基因，雖尚不能確定ITPKB、ZH2基因與MM有明確關系，但現有研究結果為MM發病機制研究提供了新的思路，可以為后續臨床治療等方面的研究提供幫助。