肥胖患者脂肪組織STAU1表達變化及其在脂肪間充質干細胞成脂分化中的作用

孟軒羽，梁小弟，努爾比耶·努爾麥麥提，焦誼，劉杰，胡婷婷，高佳樂，徐尤宗盛，張玲，關亞群

(新疆醫科大學基礎醫學院，烏魯木齊830011)

肥胖是引起2型糖尿病、高血壓、非酒精性脂肪肝等代謝性疾病的重要原因之一[1～4]，脂肪細胞的異常分化和過度增殖是導致肥胖的細胞生物學基礎。脂肪細胞分化涉及一個復雜的調控網絡，包括表觀遺傳學、轉錄水平、轉錄后水平、翻譯及翻譯后水平[5]；在轉錄水平中，過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPARγ)不僅是調控脂肪組織中前體脂肪細胞分化的關鍵因子，而且在調節脂類代謝中扮演重要的角色[6]。在轉錄后水平中，RNA結合蛋白起著重要的調節作用[7]。Cho等[8]發現，雙鏈RNA結合蛋白STAU1在小鼠脂肪細胞3T3-L1的分化過程中高表達。前期我們通過生物信息學方法預測發現，STAU1可以與PPARγ結合。2018年7～9月，我們在人脂肪組織及人脂肪間充質干細胞(hADSCs)成脂分化中檢測STAU1的表達水平，并于hADSCs中敲低STAU1表達后檢測細胞成脂情況及PPARγ表達水平變化，初步探討STAU1在人脂肪組織及hADSCs成脂分化中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 低糖培養基(DMEM)、胎牛血清(FBS)購自Hyclone；無血清培養基(Opti-MEM)購自Gibco-BRL；LipofectamineTM3000轉染試劑、TRIzol RNA提取試劑購自Invitrogen；SYBR Green Real time PCR試劑盒購自Takala；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒購自Thermo Scientific；Anti-actin、Anti-STAU1、Anti-PPARγ抗體購自Abcam；STAU1 siRNA購自廣州瑞博。熒光定量PCR儀(ABI 7500)核酸微量檢測儀購自NanoDrop；低溫高速離心機購自Thermo，熒光倒置顯微鏡購自Leica；全波長酶標儀、凝膠成像儀購自Bio-Rad；電熱恒溫培養箱購自Thermo。

1.2 實驗方法

1.2.1 人脂肪組織的獲取與臨床資料收集 選取2016年9月～2018年5月新疆維吾爾自治區人民醫院慢性膽囊結石和腹股溝疝擇期手術患者56例，均無動脈或外周血管疾病、甲狀腺功能紊亂、急性炎癥性疾病、創傷和其他需要緊急治療的病癥、惡性腫瘤、酒精或藥物濫用史者，術中留取網膜和皮下脂肪組織。將患者根據BMI分為肥胖組(BMI≥28 kg/m2)27例和非肥胖組(BMI<24 kg/m2)29例，兩組年齡、BMI、腰圍、臀圍、血壓、血糖、血脂比較，見表1。本研究均經醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

表1 兩組年齡、BMI、腰圍、臀圍、血壓、血糖、血脂比較

注：與非肥胖組比較，*P<0.05。

1.2.2 hADSCs的獲取 取人網膜脂肪組織約2 g，用含1 000 U/mL青霉素和鏈霉素的PBS清洗3遍；用眼科剪將脂肪組織剪至1 mm3大小，在37 ℃水浴中與1 mg/mL的Ⅰ型膠原酶一起溫育60 min，輕微搖晃直至看不到組織塊為止。加入20 mL PBS終止消化，將組織液以600 r/min離心10 min。棄去上清液后，將沉淀重懸于含有10% FBS和1 000 U/mL青霉素和鏈霉素的低糖DMEM中。將細胞懸浮液接種在10 cm細胞培養皿上，在37 ℃培養箱中用5% CO2培養；48 h換1次液，直至細胞融合率為80%，用胰酶消化傳代。傳代后收集細胞懸液，分為陰性對照及同型對照，分別加單克隆抗體CD44-FITC、CD105-PE在4 ℃冰箱避光孵育30 min；用PBS清洗5遍，洗掉多余的抗體后上流式細胞儀檢測細胞表面抗原。結果顯示，間充質干細胞標記抗原CD44、CD105呈陽性表達，表明分離的細胞為hADSCs。

1.2.3 hADSCs成脂分化誘導與甘油三酯形成情況觀察 當細胞融合率達85%時，將含10%FBS、1 μmol/L地塞米松、10 μmol/L胰島素、0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和200 μmol/L吲哚美辛的成脂誘導液處理hADSCs；每3 d更換培養基1次，持續8 d。分別于0、2、4、6、8 d，取上述細胞樣品；PBS清洗后以4%多聚甲醛固定30 min，用油紅O染料染色25 min。PBS清洗3遍后，加入ddH2O放在倒置顯微鏡下觀察細胞成脂情況；最后用異丙醇洗脫培養皿提取油紅O染料，在波長520 nm下測量光密度，以此表示甘油三酯生成量。

1.2.4 脂肪組織STAU1基因和hADSCs成脂分化中STAU1、PPARγ基因表達檢測 采用RT-qPCR法。PBS洗滌3.5 cm培養皿3次后(脂肪組織用研缽碾成粉末)，加入TRIzol 1 mL吹打勻漿細胞和組織；采用異丙醇氯仿方法提取細胞及組織內RNA，通過分光光度法測量RNA濃度及A260/A280，確保RNA的質量。使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA后，在ABI 7500系統下使用SYBR Select Master Mix試劑進行PCR擴增。STAU1基因上游引物5′-TGCTGGGGTTTGTTGTGATG-3′、下游引物5′-TGAGTGAGCCAGCTTGAGAA-3′，PPARγ基因上游引物5′-AAATGCGAGAGTGGGAAGGA-3′、下游引物5′-AGGGTCTTGCTATGTTGCCT-3′，由上海生工生物有限公司設計并合成。以HSP90為內參，用2-ΔΔCt法計算STAU1基因相對表達量。

1.2.5 脂肪組織STAU1蛋白和hADSCs成脂分化中STAU1、PPARγ蛋白表達檢測 采用Western blotting法。將hADSCs細胞用PBS清洗3遍后(網膜脂肪組織研磨成粉末)，在RIPA中裂解后用BCA工作液對蛋白進行定量；在10%的SDS-PAGE膠上樣電泳后轉移至PVDF膜，在5% BSA中室溫孵育2 h；將膜和一抗Anti-STAU1、Anti-HSP90、Anti-PPARγ(1∶1 000)置于5 mL一抗稀釋緩沖液中，4 ℃搖床上孵育過夜。用15 mL TBST洗滌3次，每次15 min；將二抗(1∶5 000)HRP-Anti-rabbit室溫孵育1 h，再用15 mL TBST洗滌3次，每次15 min。ECL底物進行顯色，以Image Lab軟件進行光密度分析。以HSP90為內參，用目的蛋白與內參吸光度比值表示目的蛋白相對表達量。

1.2.6 敲低STAU1對hADSCs中甘油三酯生成及PPARγ表達影響的觀察 將4×105個細胞接種于3.5 cm皿中，待融合率為60%時，加入基礎培養基2 mL饑餓8 h后；將細胞分為3組，干擾1、2組分別轉染siRNA STAU1-homo-718、STAU1-homo-923，對照組不轉染。加無血清培養基Opti-MEM 250 μL稀釋10 μL LipofectamineTM3000，室溫孵育5 min；加入5 μL siRNA用250 μL Opti-MEM進行稀釋，將脂質體LipofectamineTM3000與siRNA混合液室溫孵育30 min；加入培養皿中在37 ℃、5% CO2的培養箱中孵育1 h后換成DMEM低糖完全培養基，每2 d換液1次。轉染后2、4 d，分別檢測甘油三酯生成情況、STAU1和PPARγ基因及蛋白質表達水平，方法分別同1.2.3、1.2.4、1.2.5。siRNA由廣州博瑞設計并合成，引物序列見表2。

表2 STAU1 siRNA引物序列

2 結果

2.1 肥胖組與非肥胖組脂肪組織中STAU1基因及蛋白表達情況 肥胖組網膜脂肪組織中STAU1基因相對表達量高于非肥胖組(P<0.05)，兩組皮下脂肪組織中STAU1基因相對表達量差異無統計學意義，見表3。肥胖組網膜脂肪組織中STAU1蛋白相對表達量為2.68±0.28，高于非肥胖組的1.32±0.36(P<0.05)。

表3 肥胖組與非肥胖組脂肪組織中STAU1基因表達比較

注：與非肥胖組同型脂肪組織比較，*P<0.05。

2.2 肥胖組網膜脂肪組織中STAU1基因表達水平與患者臨床特征的關系 相關性分析顯示，肥胖組網膜脂肪組織中STAU1基因表達水平與患者的腰圍、臀圍、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、空腹血糖無明顯相關性(r分別為0.169、0.176、0.173、0.164、0.171，P均>0.05)，與BMI、甘油三酯呈正相關(r分別為0.777、0.795，P均<0.01)。

2.3 hADSCs成脂分化過程中甘油三酯生成及STAU1、PPARγ表達水平變化 隨著誘導分化天數增加，hADSCs中甘油三酯生成增多，STAU1、PPARγ表達水平逐漸升高(P均<0.05)。見表4。

表4 hADSCs成脂分化過程中甘油三酯生成及STAU1、PPARγ表達水平變化

注：與成脂分化誘導0 d時比較，*P<0.05。

2.4 敲低STAU1對hADSCs中甘油三酯生成及PPARγ表達的影響 與對照組比較，干擾1、2組轉染2、4 d時hADSCs中STAU1表達降低，甘油三酯生成及PPARγ表達減少(P均<0.05)。見表5。

表5 各組hADSCs中甘油三酯生成及STAU1、PPARγ表達比較

注：與對照組同時點比較，*P<0.05。

3 討論

隨著社會發展及生活方式的改變，肥胖得到人們越來越多的關注，其發病率在全球范圍內迅速上升[9～12]。研究發現，脂肪細胞的異常分化是導致肥胖的重要原因之一。因此，研究脂肪細胞的分化及其機制對預防和治療肥胖及相關疾病具有重要意義。脂肪細胞分化可以分為兩個階段：第一個階段為多潛能的干細胞轉變為前體脂肪細胞；第二個階段為前體脂肪細胞終末分化為成熟的脂肪細胞[13]。脂肪細胞分化存在復雜的調控網絡，如PPARγ和CEBPα轉錄因子介導的轉錄水平的調節[14]。PPARγ通過調控下游與脂代謝相關基因的表達，促進脂肪細胞的分化、增加脂肪細胞的數量，對脂肪的生成、轉運及脂肪的貯存和氧化等都起著重要作用，是脂肪細胞形成和代謝的關鍵調節因子[15]。另外，轉錄后水平也在脂肪細胞分化過程中發揮著重要作用，其中RNA結合蛋白可以參與RNA前體的剪接、RNA的細胞定位、RNA穩定性等多種轉錄后調控[16]。STAU1是重要的RNA結合蛋白，又稱STAU1人源全長重組蛋白。Cho等[17]報道，在前體脂肪細胞3T3-L1分化中，RNA結合蛋白STAU1可以通過與Kruppel樣因子2(KLF2)基因上的局部雙連結合，影響KLF2基因穩定性，使KLF2下游靶基因PPARγ表達水平升高，進而促進3T3-L1細胞內甘油三脂的生成。

本實驗在hADSCs成脂分化過程中，STAU1、PPARγ表達水平隨著誘導分化天數增加而增加，油紅O染色結果顯示成脂加快。生物信息學方法預測顯示STAU1可以與PPARγ結合，而PPARγ是脂肪細胞分化重要的轉錄因子。本研究結果顯示，在脂肪細胞中敲低STAU1后PPARγ的蛋白及基因水平降低，推測STAU1可能通過上調PPARγ的表達水平進而加速甘油三酯的生成,此外，在人脂肪組織中發現STAU1基因和蛋白水平在肥胖患者網膜脂肪組織中表達升高，差異有統計學意義，而在皮下脂肪組織中無統計學意義。Serralde-Zúniga等[18]研究發現，脂肪組織在脂代謝和病理生理方面有明顯的部位特異性，網膜脂肪的積聚較皮下脂肪對人體危害更加明顯。因此，STAU1在網膜脂肪組織高表達可能與內臟肥胖導致的代謝性疾病相關。相關性分析發現，網膜脂肪組織中STAU1基因表達與肥胖組BMI和甘油三酯呈正相關。甘油三酯是組成脂質的主要成分，脂肪酸作為合成甘油三酯的直接底物，脂肪酸合成增多直接加速了甘油三酯的合成；PPARγ可以通過調節脂肪酸合成酶的速率，加速脂肪酸合成的進程，進而增加了甘油三酯的合成[19，20]。這提示STAU1在脂肪組織及脂肪細胞中可能通過上調PPARγ的表達，促進甘油三酯的生成，從而導致肥胖的發生。

綜上所述，雙鏈RNA結合蛋白STAU1，在人網膜脂肪組織及hADSCs成脂分化過程中高表達，STAU1可通過調節PPARγ表達水平來影響人體脂肪的形成，從而在肥胖的發生發展中起重要作用，但具體調控機制還有待進一步研究。