PI3K抑制劑對2型糖尿病小鼠腦組織中乙酰膽堿酯酶表達的影響

朱霞，張亮，2，印曉星，劉耀武

(1徐州醫科大學藥學院江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇徐州221004;2鶴壁市人民醫院)

糖尿病相關認知功能障礙是近年來研究較多的糖尿病并發癥之一，主要表現為學習能力障礙、思維記憶能力下降，病程進展到后期患者會出現生活不能自理，嚴重影響其生存質量［1］。雖然，糖尿病認知功能障礙的發病機制復雜，但中樞膽堿能神經系統功能紊亂是重要原因之一。大量研究表明，糖尿病動物表現出明顯的認知功能損害，伴有大腦皮層和海馬等部位的乙酰膽堿酯酶(AchE)表達增加［2～4］，AchE抑制劑能夠改善糖尿病認知功能障礙［5，6］。在糖尿病腦病的發病機制中，脂質過氧化和蛋白質損害扮演著極其重要的角色。其中，丙二醛(MDA)水平是體內氧化應激活躍程度的標志物。在腦的學習和記憶功能中，特別是腦的長期記憶功能中，蛋白質翻譯過程和新蛋白質合成起到至關重要的作用。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)作為PI3K/Akt通路下游重要的效應蛋白［7］，不僅調控蛋白質翻譯，還參與蛋白質降解、核糖體合成等生理過程，而且與衰老、腫瘤、糖尿病及其并發癥的發生也關系密切。例如:活化的mTORC1可磷酸化其下游蛋白70 kD核糖體S6蛋白激酶(p70S6K)，促進細胞的生長、增殖等［8］。那么，糖尿病狀態下，腦內mTOR信號是否過度激活并參與了AchE合成的調控，mTOR通路對AchE蛋白合成的調控是否與PI3K/Akt通路有關，尚未可知。2017年9月～2018 年3月，我們觀察了自發性2型糖尿病模型動物db/db小鼠腦組織中mTOR信號和AchE蛋白表達的變化，以及PI3K抑制劑LY294002對其的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 12周齡2型糖尿病模型動物C57BL/KSJ db/db小鼠及同周齡非糖尿病動物C57/KSJ db/m小鼠，由南京軍區總醫院實驗動物中心提供。試劑:PI3K抑制劑LY294002(美國Sigma公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(杭州碧云天生物技術研究所)，葡萄糖測定試劑盒(上海榮盛生物藥業有限公司)，AchE檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);二硝基苯肼(上海阿拉丁試劑有限公司)，氯化四乙銨(上海源葉生物科技有限公司);mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR，Ser2448)和磷酸化p70S6K(p-p70S6K，Thr389)抗體(美國Cell Signaling公司)，p70S6K抗體(英國Abcam公司)，AchE抗體(美國Bioworld公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與干預處理 將16只db/db小鼠適應性飼養3 d后，隨機分為抑制組和模型組各8只，分別腹腔注射溶于5% DMSO中的LY294002 3 mg/kg和相同體積的5% DMSO溶液。將6只同周齡db/m小鼠作為正常對照組，腹腔注射相同體積的生理鹽水。各組小鼠連續給藥7 d，摘除眼球采血，收集血液，分離血清;處死，剝取大腦皮質，置于－70℃冰箱保存。

1.2.2 血糖和血清MDA檢測 采用Elx808IU酶標儀(美國BioTek公司)，以氧化酶法檢測葡萄糖。采用HPLC-UV法檢測血清MDA，按照文獻［9］的方法進行:依據樣本中MDA和衍生化試劑二硝基苯肼反應，生成的產物在310 nm波長處有最大紫外吸收的特點進行測定;MDA標準溶液是通過已知濃度的氯化四乙銨貯備液的酸水解而獲得，然后按比例稀釋得到不同濃度的標準溶液。

1.2.3 大腦皮質中AchE活性檢測 采用酶底物法。取大腦皮質，用生理鹽水制備成10%的勻漿，離心取上清液。BCA法測定總蛋白濃度，按照試劑盒操作步驟測定AchE。

1.2.4 大腦皮質中AchE、mTOR和p70S6K磷酸化水平測定 采用Western blotting法。取大腦皮質，用全細胞裂解液進行超聲破碎，離心取上清液。BCA法測定樣本蛋白濃度后，各組用裂解液配平，加上樣緩沖液，沸水變性。將40 μg蛋白在SDS-PAGE凝膠系統上樣電泳，濕轉法將蛋白轉至PVDF膜上。封閉后加一抗，4℃孵育過夜;室溫下PBS洗去一抗，加入二抗室溫孵育2 h。室溫下PBS洗去二抗，用圖像處理儀(Gene Company)軟件分析圖像，Image J分析軟件進行灰度分析。以GAPDH為內參，分別以p-mTOR灰度值/T-mTOR灰度值、p-p70S6K灰度值/T-p70S6K灰度值表示mTOR和p70S6K磷酸化水平。以AchE與GAPDH灰度比值表示AchE相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。數據以珋x±s表示，兩組間比較行t檢驗，多組間比較行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血糖、血清MDA水平比較 與正常對照組比較，模型組血糖和血清MDA水平均增高(P均＜0.01);與模型組比較，抑制組血清MDA水平降低(P＜0.05)，而血糖水平差異無統計學意義。見表1。

表1 各組血糖和血清MDA水平比較(珔x±s)

＊＊正常對照組6 8.18±1.44 2.391±0.124

注:與正常對照組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05。

2.2 各組大腦皮質中AchE活性和表達水平比較模型組大腦皮質中AchE活性和表達量分別為(1.654±0.104)U/mg protein、0.957±0.089，高于正常對照組的(1.334±0.143)U/mg protein、0.508 ±0.222(P＜0.05或＜0.01);抑制組大腦皮質中AchE表達量(0.506±0.161)低于模型組(P＜0.05)，而與正常對照組差異無統計學意義;抑制組大腦皮質中AchE活性為(1.473±0.091)U/mg protein，較模型組沒有明顯降低。

2.3 各組大腦皮質中mTOR和p70S6K蛋白磷酸化水平比較 與正常對照組比較，模型組大腦皮質中mTOR和p70S6K磷酸化水平均增加(P均＜0.05);與模型組比較，抑制組大腦皮質中mTOR和p70S6K磷酸化水平降低(P＜0.05或＜0.01)。見表2。

表2 各組大腦皮質中mTOR和p70S6K蛋白磷酸化水平比較(珔x±s)

*正常對照組8 0.917±0.141 0.790±0.132

注:與正常對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，##P＜0.01。

3 討論

糖尿病患者往往存在學習、記憶能力等方面的認知功能障礙，而中老年人群中即使合并輕度認知功能障礙，遠期老年癡呆發生率亦可達30%～40%［10］。研究表明，氧自由基代謝和膽堿酯酶水平異常在輕度認知功能障礙發生發展過程中發揮著關鍵作用［11］。本研究結果顯示，在自發性2型糖尿病小鼠腦內AchE表達增加，同時伴有腦內的mTOR/p70S6K通路激活;PI3K抑制劑LY294002可抑制mTOR通路激活，降低AchE表達。這表明在2型糖尿病狀態下腦內AchE表達上調，而PI3K/Akt/mTOR通路激活可能介導了這一作用。該發現為糖尿病認知功能障礙的防治提供了新思路。

在高糖條件下，氧化應激增加引起海馬組織結構異常，導致學習記憶功能障礙［12，13］。糖尿病大鼠認知功能障礙時，AchE表達增加，伴隨著體內氧化應激水平的增加，如腦內抗氧化系統減弱及脂質過氧化水平增加［2～4，14］。另外，抗氧化劑可顯著降低AchE表達從而改善糖尿病認知功能障礙［4，14，15］。Dabidi等［16］發現，氧化應激造成腦組織損傷，隨著病程的進展，腦損傷逐漸積累，導致神經細胞變性甚至壞死，進而發生中樞神經系統慢性不可逆性損傷，導致糖尿病認知障礙的發生。MDA是腦組織脂質過氧化產物，特別是腦組織損傷時，大量氧自由基可以使脂質過氧化，所以MDA水平可以提示糖尿病時氧化應激活躍程度。本研究結果顯示，模型組血清MDA水平較正常對照組增加，表明氧化應激在糖尿病認知功能障礙發生發展中有重要作用;而抑制組給予PI3K抑制劑LY294002后可以降低血清MDA水平，提示PI3K抑制劑能減少腦內氧化應激的損傷程度。

乙酰膽堿廣泛參與到機體的高級神經功能活動中，而作為其水解酶，AchE具有調節神經功能、改善大腦思維及記憶等多方面的作用。許多研究已表明，糖尿病認識功能障礙的發生與腦內AchE功能障礙有關，AchE活性上升可引起認知功能下降，且絕大部分輕度認知功能障礙患者合并膽堿能神經功能下降［2～6］。本研究結果表明，在自發性2型糖尿病db/db小鼠腦內AchE表達增加，伴有血中脂質過氧化產物MDA水平增加。這說明糖尿病狀態下氧化應激可能有助于AchE的損害，這與文獻［3，4］的報道相一致。

PI3K是生長因子受體超家族信號轉導通路中的重要激酶，PI3K磷酸化后激活Akt進而參與眾多生物學過程的調控。mTOR屬于磷脂酰肌醇相關激酶家族成員，是PI3K/Akt通路下游的重要效應蛋白。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，介導多種細胞信號傳遞并調節轉錄、翻譯、自噬及核糖體合成等過程，在細胞生長和增殖分化等方面起著至關重要的作用。研究發現，mTOR調控蛋白質翻譯，而且與糖尿病及其并發癥的發生有密切關系［8］。作為一種功能廣泛的大分子蛋白質，mTOR可在多個位點發生磷酸化，如Ser1261、Thr2446及Ser2448等，磷酸化的mTOR可進一步激活下游靶分子進而調節細胞活動。其中，Ser2448磷酸化是mTOR接受上游Akt信號的主要位點［17］。p70S6K是mTOR最重要的下游位點之一。在高糖條件下，細胞內mTOR被磷酸化激活，導致其下游通路p70S6K過度表達。在本研究中我們發現，2型糖尿病db/db小鼠大腦皮質mTOR通路被激活，即mTOR及其下游激酶p70S6K的磷酸化水平均增加，表明腦內AchE表達上調可能與mTOR通路激活有關。

由于PI3K/Akt是調控mTOR信號的重要通路之一［7］，本研究對慢性2型糖尿病db/db小鼠腹腔注射PI3K抑制劑LY294002后，其大腦皮質AchE表達降低、mTOR/p70S6K通路被抑制，提示PI3K/Akt/mTOR通路激活介導了糖尿病狀態下腦內AchE的表達上調。研究表明，氧化應激可以激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，阻斷該通路可以減少視網膜上皮細胞的凋亡［18］。大量研究表明，ROS過多激活了PI3K/Akt/mTOR通路，促進了糖尿病并發癥如腎病和心血管疾病的發生［19，20］。本研究發現，PI3K抑制劑LY294002可以通過降低氧化應激水平，從而抑制mTOR及下游p70S6K的磷酸化。在本研究中PI3K抑制劑LY294002對db/db小鼠的血糖無明顯影響，從而排除了PI3K抑制劑通過影響血糖而間接影響mTOR通路的可能。Ma等［21］報道，在2型糖尿病大鼠海馬中，mTOR通路激活可能與胰島素信號通路損害有關，進一步說明PI3K/Akt通路可能參與了糖尿病狀態下腦內mTOR通路的激活。此外，我們前期研究［22］發現，在高糖培養的中樞神經細胞系HT-22細胞及1型糖尿病大鼠腦內AchE表達上調與PI3K/Akt/mTOR通路激活有關。

綜上所述，在糖尿病狀態下大腦皮質AchE表達發生上調，這與PI3K/Akt/mTOR通路激活有關，可能為糖尿病性認知功能障礙發生的機制之一。PI3K抑制劑LY294002是通過降低氧化應激水平，抑制mTOR相關通路的活性，減少AchE表達，從而發揮腦保護作用，可為糖尿病相關認知功能障礙的防治提供研究靶點。