鳥苷酸交換因子C3G過表達對高糖誘導心肌細胞H9C2凋亡的影響及機制

張旭，陳旺盛，張夢嬌，蔣文捷，梁雪梅

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000)

目前全球有超過3億的糖尿病患者，而糖尿病引起的心臟改變是其發生心力衰竭和導致死亡的主要原因。持續的高血糖水平可使心肌細胞發生廣泛變性、壞死與凋亡，最終導致心肌功能障礙、心臟功能衰竭[1]。多項研究提示，心肌細胞凋亡與糖尿病心肌病(DCM)的發生發展有直接關系，而目前與DCM中心肌細胞凋亡相關的分子機制仍不清楚[2]。因此，深入探討DCM的凋亡機制并找到調控的靶點，對于DCM的干預具有深遠的理論與臨床意義。鳥苷酸交換因子C3G是結合在接頭蛋白(Crk)SH3結構域中的主要蛋白，在人體組織中廣泛表達[3]。研究提示，C3G高表達于大鼠的腦、心臟、肝臟和肌肉等組織中，主要參與胚胎發育、細胞分化、增殖、凋亡等重要生物學行為，尤其在心肌細胞及神經系統胚胎發育中起重要作用[4]。多項研究結果顯示，與凋亡有關的蛋白或多或少都與C3G有關，而這些凋亡蛋白同樣作用于心肌細胞[5]。所以，我們有理由認為C3G在心肌細胞凋亡過程中發揮重要作用。2015年7月～2018年1月，我們觀察了過表達C3G對高糖環境中心肌細胞凋亡的影響，以及C3G上游信號分子CrkL、下游信號分子磷酸化細胞外調節蛋白激酶1/2(ERK1/2)表達變化，以期為DCM的發病及其防治尋找新的理論依據，并從信號分子途徑為C3G作為DCM的臨床干預靶點提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料 陰性慢病毒和C3G過表達慢病毒均由上海吉凱公司構建合成，大鼠H9C2胚胎心肌細胞購自中科院上海生命科學研究院，DMEM培養基、胎牛血清(FBS)、D-葡萄糖均購自美國Gibco公司；小鼠抗大鼠β-actin抗體(sc-47778)、兔抗大鼠C3G抗體(sc-15359)購自Santa Cruz公司，小鼠抗大鼠CrkL抗體(3182)、兔抗大鼠p-ERK1/2抗體(4370)購自Cell Signaling公司；流式細胞技術所用試劑(Annexin V-FITC、PI)購自江蘇碧云天生物研究所。

1.2 心肌細胞培養與慢病毒感染 將對數生長期的心肌細胞分別接種于6個直徑為10 cm的培養皿中，在含10% FBS、低糖(5 mmol/L)的DMEM普通培養基中培養；當細胞密度達60%左右后換液分為兩份，分別用空白試劑(低糖培養基)、陰性病毒、過表達C3G慢病毒感染。培養24 h后，重新消化細胞并計數。

1.3 心肌細胞高糖干預模型建立 分別取上述感染后的細胞，接種于6個平板中(Western blotting用培養皿，流式細胞計數用6孔板)，普通培養基培養6 h讓其充分貼壁；將其中一份培養基置換為含10% FBS、5.5 mmol/L D-葡萄糖的培養基，標記為空白組、陰性病毒組、過表達C3G組；另一份培養基置換為含10%FBS、33.3 mmol/L D-葡萄糖的培養基，標記為空白+高糖組、陰性病毒+高糖組、過表達C3G+高糖組；各組均繼續培養72 h，熒光顯微鏡下顯示細胞的病毒感染率均>90%以上停止培養。

1.4 心肌細胞凋亡率測算 采用流式細胞術。收集各組細胞，將其懸浮后按凋亡檢測試劑盒說明書步驟依次加入Annexin V-FITC、PI后行流式細胞儀檢測。細胞凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.5 心肌細胞C3G、p-ERK1/2和CrkL蛋白檢測 采用Western blotting法。收集各組細胞，提取細胞總蛋白；BCA法檢測蛋白濃度，用10% SDS-聚丙烯酰胺分離凝膠。各組分別上樣30 μg蛋白，電泳分離后電轉至PVDF膜上；4%牛奶37 ℃封閉2 h后，分別加一抗孵育12 h以上，洗膜；孵育二抗，再洗膜；然后通過 ECL發光試劑盒顯影成像，進行吸光度值定量分析。實驗重復3次，采用Quantity-One軟件分析各組蛋白的相對表達量。用C3G與內參β-actin吸光度比值表示C3G蛋白相對表達量，同法計算p-ERK1/2和CrkL蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組心肌細胞凋亡率比較 與空白組(3.241%±0.869%)、陰性病毒組(3.428%±1.086%)比較，過表達C3G組細胞凋亡率(1.493%±0.626%)降低，而空白+高糖組(10.776%±2.284%)、陰性病毒+高糖組(10.934%±2.368%)細胞凋亡率增加(P均<0.05)；與空白+高糖組、陰性病毒+高糖組比較，過表達C3G+高糖組(5.633%±1.629%)細胞凋亡率降低(P均<0.05)。

2.2 各組心肌細胞C3G、p-ERK1/2和CrkL表達比較 與空白組、陰性病毒組比較，過表達C3G組C3G、p-ERK1/2蛋白表達均增加(P均<0.05)而CrkL蛋白表達無差異，空白+高糖組、陰性病毒+高糖組C3G、p-ERK1/2和CrkL蛋白表達降低(P均<0.05)；與空白+高糖組、陰性病毒+高糖組比較，過表達C3G+高糖組C3G、p-ERK1/2蛋白表達均增加(P均<0.05)，而CrkL蛋白表達無差異。見圖1、表1。

注：A為空白組,B為陰性病毒組,C為過表達C3G組,D為空白+高糖組,E為陰性病毒+高糖組,F為過表達C3G+高糖組。

圖1各組心肌細胞C3G、p-ERK1/2、CrkL蛋白表達(Western blotting法)

表1 各組心肌細胞C3G、p-ERK1/2和CrkL蛋白相對表達量比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與陰性病毒組比較，bP<0.05；與過表達C3G組比較，cP<0.05；與空白+高糖組比較，dP<0.05；與陰性病毒+高糖組比較，eP<0.05。

3 討論

DCM是發生在獨立于冠心病或高血壓引起的心肌損害以外的糖尿病心肌改變，從第一次概念的提出，至今已有40多年，然而其發生的確切機制目前仍不完全清楚[6]。從國內外的研究結果顯示，糖尿病的慢性高血糖會導致心肌氧化應激、代謝紊亂，心肌細胞肥大、凋亡、纖維化和收縮功能障礙,最終導致DCM[7,8]。目前，心肌細胞氧化應激損傷是研究的熱點，而對于DCM的凋亡機制目前仍無確切的結果。

作為細胞主要表面受體的整合素家族，參與了心肌細胞的生長發育、增殖、分化、凋亡等多個生理過程。例如：整合素家族的β1、β3亞基及其下游的多個信號分子都具有抑制心肌細胞凋亡、促進心肌細胞生長，對梗死后心臟重塑、心力衰竭的發生發展具有重要的保護作用[9,10]。C3G作為整合素信號通路成員之一，可能參與梗死后心臟重構、缺血性心肌病和心力衰竭的發生發展[11,12]。研究提示，C3G基因缺失會引起果蠅幼體心血管及神經系統的畸形和功能障礙，導致幼體死亡[13]；因此，我們推測C3G可能通過改善2型糖尿病的氧化損傷、凋亡等途徑來預防心血管并發癥[14]。CrkL作為C3G上游信號分子，過表達可以抑制缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡[15]。ERK是一種絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，可能存在于整合素信號通路的下游，介導細胞多種生物化學反應。p-ERK1/2能夠調控細胞的凋亡、增殖等過程，并且對心肌細胞有明顯保護作用[16,17]。

在我們的前期研究中發現，C3G在大鼠心肌細胞中存在表達，過表達C3G質粒可增加大鼠心肌細胞中C3G蛋白表達；并且，C3G過表達質粒具有降低心肌細胞凋亡、促進其增殖生長的能力；C3G過表達質粒還能顯著降低大鼠心肌細胞因缺氧/復氧損傷引起的心肌細胞凋亡，增加其增殖能力[11,18]。本研究結果顯示，在高糖環境下，心肌細胞出現大量壞死、凋亡，C3G、p-ERK1/2、CrkL蛋白表達均下降，細胞凋亡率增加；經過感染過表達C3G慢病毒后，可以增加高糖環境下心肌細胞C3G蛋白表達，抑制心肌細胞發生凋亡、壞死。由此，我們可以得出，過表達C3G可以抑制高糖環境下的心肌細胞凋亡，具有保護高糖環境中心肌細胞的作用。當心肌細胞受到持續高糖損傷時，我們也觀察到p-ERK1/2蛋白表達顯著增加；而作為C3G上游信號分子CrkL，其在過表達C3G組卻沒有差異。由此，我們進一步可以推測，過表達C3G抑制高糖環境中心肌細胞發生凋亡壞死的機制與促進p-ERK1/2蛋白表達有關。在此基礎上，我們可以進一步研究探討心肌細胞中是否存在C3G-ERK1/2信號通路或者C3G與其他有關抑制心肌細胞凋亡的信號分子。

綜上所述，本研究結果表明，持續高糖環境能引起心肌細胞凋亡增加；過表達C3G可以降低高糖環境中心肌細胞的凋亡，保護心肌細胞，其機制可能與促進p-ERK1/2蛋白表達有關。本研究為過表達C3G抑制糖尿病引起的心肌細胞凋亡提供了可能的理論依據，隨著研究的深入，會有越來越多的研究進一步證實C3G在DCM中的心肌保護作用，也將進一步明確其互相作用的信號通路，C3G有望成為探索DCM發病機制的新靶點。