奧美沙坦酯對糖尿病腎病大鼠腎臟保護作用及對腎組織Nephrin、VEGF表達的影響

朱曉娜，王玉環，吳娟娟，董鵬，張敏

(1西安交通大學第二附屬醫院，西安710004；2西安醫學院第一附屬醫院)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病主要的微血管并發癥之一，也是糖尿病患者致殘率、致死率不斷上升的主要原因。微量白蛋白尿或蛋白尿是DN最早出現的臨床癥狀，其發生機制目前尚不清楚。越來越多的證據表明，腎小球足細胞損傷與DN進展性蛋白尿的產生密切相關。研究表明，血管內皮生長因子(VEGF)可影響足細胞Neohrin的表達，誘導足細胞足突融合。腎素-血管緊張素系統激活與DN的進展關系密切，其中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)在DN的發病機制中起重要作用[1,2]，早期使用 AngⅡ受體抑制劑(ARBs)可預防和改善DN患者蛋白尿的出現。2011年新英格蘭雜志發表的ROADMAP研究顯示，奧美沙坦酯可延緩或者預防2型糖尿病患者微量白蛋白尿的發生[3]；DN動物實驗研究顯示，早期使用ARBs對DN蛋白尿的改善作用可能與其對足細胞的保護作用有關[4,5]。2014年1月～2015年12月，我們觀察了奧美沙坦酯干預對DN大鼠腎臟的保護作用，并通過觀察腎組織足細胞標志性蛋白Nephrin和VEGF的表達變化，探討其保護腎臟功能的機制。

1 材料與方法

1.1 動物準備 健康雄性8周齡SD大鼠共30只，購于西安交通大學醫學院實驗動物中心(許可證號SCXK陜2007-001)，清潔級，體質量180～220 g。每籠5只，飼養于SPF標準實驗室，溫度(23±2)℃、濕度55%±5%，每日12 h光照維持晝夜循環，自由進食飲水，每日更換墊料、飼料及飲水。所有動物實驗得到西安交通大學實驗動物管理委員會許可，動物實驗過程符合《西安交通大學動物實驗管理指南》。

1.2 動物分組與造模 將大鼠普通標準飼料適應性飼養1周后隨機分為NC組10只和實驗組20只。實驗組腹腔注射1% 鏈脲佐菌素(STZ) 65 mg/kg(Sigma公司，避光溶解于0.1 mmol/L pH 4.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)，NC組腹腔注射同體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h后禁食尾靜脈取血，空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L為造模成功；注射STZ 4周后，代謝籠內收集24 h尿液檢測尿蛋白，并尾靜脈取血檢測FBG、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)。造模過程中實驗組大鼠FBG不達標2只，DN造模成功18只。

1.3 藥物干預 將實驗組DN造模成功的18只大鼠隨機分為兩組各9只，DN組予以0.5%羥甲基纖維素鈉灌胃，OM組予以奧美沙坦酯(Melone公司)10 mg/kg溶解于0.5%羥甲基纖維素鈉灌胃；從第4周起開始干預，共干預8周。

1.4 腎臟功能指標檢測 干預8周后，代謝籠內收集24 h尿液檢測尿蛋白，禁食不禁水后尾靜脈取血檢測Scr、BUN。

1.5 腎組織病理觀察 腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉大鼠，暴露腹腔，用DEPC水處理過的手術器械取出左右腎臟，冰盒上清除腎臟表面包膜及周圍游離結締組織。將左腎沿橫截面切開后置于4%甲醛溶液中固定保存，右腎放入凍存管并置于液氮中保存。取大鼠左腎組織進行石蠟包埋切片，進行HE和PAS染色，觀察腎組織病理變化。

1.6 腎組織VEGF、Nephrin mRNA檢測 采用RT-PCR法。取大鼠右側腎皮質，用TRIzol法提取總RNA；進行逆轉錄反應，所得產物以實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)行實時定量熒光PCR反應。反應條件：95 ℃ 30 s預變性，95 ℃ 5 s, 40個循環，56 ℃(GAPDH，Nephrin)/58 ℃(VEGF)40 s退火。引物由上海捷瑞生物公司設計合成：GADPH上游引物5′-CAACGGGAAACCCATCACCA-3′、下游引物5′-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT-3′，VEGF上游引物5′-TTCGTCCAACTTCTGGGCTCTT-3′、下游引物5′-CTCCTCTTCCTTCTCTTTCTCCC-3′，Nephrin上游引物5′-TGTGTACCTGGGGTCTTGGA-3′、下游引物5′-AGGACTGGTTCGTCTTGTCG-3′。以2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.7 腎組織VEGF、Nephrin蛋白檢測 采用Western blotting法。取大鼠右側腎皮質50 mg，加入蛋白裂解液RIPA研磨后冰上靜置30 min；4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，上清液即為蛋白產物。采用BCA法測定蛋白濃度后，以1∶4的比例加入5×Reducing Sample Buffer；混勻后離心，100 ℃加熱3 min變性。采用10% SDS-PAGE凝膠恒壓120 V電泳90 min，使用PVDF膜在恒流200 mA并且冰袋降溫的條件下轉膜2.5 h。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜4次后一抗稀釋(1∶2 000，Proteintech公司)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜4次后二抗稀釋(1∶5 000，Santa公司)37 ℃孵育2 h。TBST洗膜4次后，膜上滴加ECL發光液；置于化學發光檢測系統曝光5 min，記錄存儲圖片，以目的條帶與內參β-actin灰度比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組腎臟功能指標比較 見表1。

表1 各組24 h尿蛋白、Scr、BUN比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與DN組比較，#P<0.05。

2.2 各組腎組織病理情況 NC組腎臟組織結構清晰可見，球囊壁光滑，毛細血管及系膜細胞、系膜基質分布正常，基底膜未見增厚；DN組腎臟組織可見不同程度的基底膜增厚、系膜基質的增加，部分腎臟組織還可見腎小球內毛細血管擴張、腎小球硬化、腎小囊裂隙樣改變以及腎小管上皮細胞的顆粒樣變性和空泡樣改變；OM組腎小球基底膜增厚及系膜基質增加的程度較DN組減輕。

2.3 各組腎組織Nephrin、VEGF mRNA及蛋白表達比較 見表2。

表2 各組腎組織中Nephrin、VEGF mRNA及蛋白表達比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與DN組比較，#P<0.05。

3 討論

腎素-血管緊張素系統激活與DN的進展關系密切。腎素主要由腎臟產生，進入血液循環后可將血管緊張素原水解為AngⅠ，AngⅠ可在血管緊張素轉換酶(ACEI)作用下水解為AngⅡ，AngⅡ主要是通過激動血管緊張素受體AT1發揮作用。AngⅡ在DN蛋白尿的發病機制中起重要作用[1,2]。通過對糖尿病患者及動物模型的研究發現，ARBs類藥物可降低蛋白尿，對腎臟有一定保護作用[6,7]。奧美沙坦酯是一種新型ARBs，與傳統ARBs相比其突出的特點是高度選擇性。它可以與AT1的2個位點結合，一個是-OH，另一個是-COOH，而其他ARBs只與AT1的-OH結合。因此，奧美沙坦酯的作用更加持久穩定。2011年新英格蘭雜志發表的ROADMAP研究發現，通過對4 447例2型糖尿病患者隨機、雙盲、多中心臨床對照試驗，發現奧美沙坦酯治療組及安慰劑治療組蛋白尿發生率分別為8.2%和9.8%，奧美沙坦組發生微量白蛋白尿時間延長23%,顯示奧美沙坦酯可延緩或預防2型糖尿病患者微量白蛋白尿的發生[3]。在糖尿病動物實驗中也同樣發現，奧美沙坦酯可明顯降低糖尿病大鼠尿蛋白，改善腎臟功能[8]。在本研究中我們發現，給予奧美沙坦酯灌胃治療后，DN組尿蛋白減少，Scr、BUN降低。這些與上述文獻報道結果一致，提示奧美沙坦酯有一定的腎臟保護作用。

目前，人們普遍認為腎小球足細胞損傷在DN的發生發展中起著重要作用。足細胞損傷受各種理化因素影響，足細胞裂孔隔膜上表達的各種蛋白分子均可作為其損傷的標志物。Nephrin是調節足細胞裂孔隔膜結構和功能的重要蛋白，可影響腎小球濾過膜的通透性及蛋白尿的產生。在對包括DN在內的一些腎臟蛋白尿疾病患者及動物模型的研究中發現，腎小球Nephrin mRNA及蛋白質的表達水平下降，且在腎小球足細胞足突融合和消失及蛋白尿出現之前就出現明顯下降。體外足細胞實驗還發現，在魚精蛋白誘導的足細胞損傷足突融合過程中，Nephrin蛋白的磷酸化較正常足細胞增多。自從將Nephrin蛋白的磷酸化及脫磷酸化與足細胞損傷及蛋白尿聯系起來后發現，Nephrin蛋白在生理學上對足細胞的分子結構及功能有著重要作用。這些可說明Nephrin在腎臟蛋白尿疾病的病理學進展中發揮重要作用，被作為腎臟蛋白尿疾病早期足細胞損傷的重要標志物之一。本實驗研究發現，DN組腎組織Nephrin mRNA及蛋白表達較NC組減少，OM組用奧美沙坦酯干預后腎組織Nephrin mRNA及蛋白表達增加。這提示DN大鼠出現了足細胞損傷，而奧美沙坦酯對DN足細胞損傷有一定修復作用。

在以往的研究報道中，Jia等[9]給予SD大鼠AngⅡ喂養14 d后可出現高血壓和蛋白尿，足細胞裂孔隔膜變窄以及Nephrin mRNA和蛋白表達增加，喂養28 d后可明顯發現足細胞凋亡及Nephrin mRNA和蛋白表達減少，并且足細胞凋亡數與Nephrin表達呈負相關。有學者進一步進行動物實驗和細胞實驗后發現，AngⅡ導致Nephrin脫磷酸化及足細胞凋亡與Caveolin-1磷酸化相關，并且推測Ang Ⅱ-Caveolin-1-Nephrin信號通路可為腎素-血管緊張素系統相關足細胞損傷疾病的治療提供新靶點[10]。動物實驗研究顯示，奧美沙坦酯對DN蛋白尿的改善作用可能與其對足細胞的保護作用有關[4,5]。這些研究結果均提示，AngⅡ的增多可能導致足細胞損傷。本實驗中OM組給予ARBs奧美沙坦酯干預后，DN大鼠足細胞損傷改善，尿蛋白排泄、Scr、BUN降低。我們推測，奧美沙坦酯的腎臟保護作用與其阻斷AngⅡ信號傳導，導致Nephrin表達上調有關。

通過對牛視網膜血管內皮細胞的體外研究發現，AngⅡ可促進VEGF的釋放。Kang等[11]研究發現，在足細胞中加入AngⅡ后，VEGF蛋白及mRNA的表達增加與AngⅡ存在劑量依賴性關系，在給予氯沙坦后AngⅡ誘導的VEGF蛋白及mRNA的表達增加被抑制。動物實驗顯示，DN大鼠腎臟組織中VEGF表達明顯升高、尿蛋白增多，給予AngⅡ受體阻滯劑L158809干預后大鼠VEGF表達下調、尿蛋白減少。本實驗中，DN大鼠VEGF mRNA和蛋白表達增多，給予奧美沙坦酯干預后VEGF mRNA和蛋白表達減少，與上述文獻報道一致。

VEGF與DN足細胞損傷、蛋白尿出現關系密切。有研究發現，VEGF-A的基因多態性與糖尿病視網膜病變及DN有關[12,13]。人體腎臟組織活檢發現，在DN早期VEGF mRNA表達增多[14]；同樣，在嚙齒類DN動物模型中也發現VEGF表達增多[15]。體內實驗發現，VEGF亞型VEGF165可誘導足細胞Nephrin及VEGFR2酪氨酸磷酸化，導致足細胞足突融合[16]。有學者在阿霉素誘導的大鼠腎臟蛋白尿疾病模型中發現，VEGF表達較正常大鼠明顯升高，同時Nephrin表達下降。上述研究均提示VEGF與足細胞損傷關系密切，可調控Nephrin的表達。本實驗中奧美沙坦酯干預后DN大鼠VEGF表達減少，Nephrin表達上調，尿蛋白排泄減少。由此我們推測，奧美沙坦酯可阻斷AngⅡ信號傳導，進而下調VEGF表達、上調Nephrin表達，從而減少大鼠尿蛋白的排泄，對腎臟有一定保護作用。