磁共振(MRI)擴散峰度成像(DKI)與拉伸指數模型(SEM)評價裸鼠原位肝細胞癌(HCC)異質性

郭 然 林 江 楊爍慧,3△ 韓志宏 嚴 序 傅彩霞 趙夢龍

(1上海市影像醫學研究所 上海 200032; 2復旦大學附屬中山醫院放射科 上海 200032;3上海中醫藥大學附屬曙光醫院放射科,4病理科 上海 200021;5西門子醫療磁共振科研市場部 上海 201318;6西門子(深圳)磁共振有限公司應用開發部 深圳 518057)

腫瘤異質性 (tumor heterogeneity) 是指腫瘤內及腫瘤間存在的基因和表型的差異,受到基因與環境的共同作用,是造成腫瘤致死、治療無效及藥物抵抗的重要原因之一[1-2]。腫瘤異質性一定程度上反映了腫瘤的生物學特征,如生長方式、侵襲能力和對藥物的敏感性等,它涵蓋多方面,其中包括隨著腫瘤的發生、發展及與治療相關的空間及時間異質性[3]。

磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)擴散加權成像(diffusion weighted imaging,DWI)可用于評估腫瘤細胞增殖和腫瘤壞死程度[4]。由于腫瘤組織內水分子擴散不符合高斯分布,傳統DWI模型無法評價腫瘤的異質性[5]。有研究指出MRI擴散峰度成像(diffusion kurtosis imaging,DKI)和拉伸指數模型(stretched exponential model,SEM)有助于腫瘤異質性的評估,并可用于鑒別腫瘤良惡性、區分高低級別、評價預后以及監測療效[5-8]。

目前,使用DKI和SEM評估肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)腫瘤異質性的報道較少[9-11],而與組織病理學相對照的研究更少。本實驗通過建立裸鼠原位HCC模型,觀察在自然生長狀態下腫瘤的空間異質性及隨時間延長而改變的時間異質性,分析不同時間點間DKI和SEM各參數間的差異,以及各參數與組織病理學指標之間的相關性,從而客觀評估DKI和SEM方法用于觀察HCC腫瘤空間和時間異質性的價值。

材 料 和 方 法

實驗造模和實驗方案 本實驗通過復旦大學附屬中山醫院實驗動物管理委員會備案和批準。使用人HCC-LM3細胞系和4～6周齡體質量為23～25 g的BALB/c雄性裸鼠(中國科學院上海藥物研究所)建立裸鼠原位HCC模型[4]。將相同體積人HCC-LM3細胞瘤塊(1 mm3)植入25只裸鼠肝左葉包膜下,并將25只瘤鼠隨機分為A、B、C、D和E組,每組5只,分別在腫瘤生長至第21、28、35、42和49天進行MRI掃描[12]。

MRI掃描方法 瘤鼠按40 mg/kg腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉進行麻醉,然后俯臥位固定于動物架上,在西門子MAGNETOM Aera 1.5T磁共振成像儀上使用16通道腕關節線圈分別進行常規MRI (T1WI和T2WI橫斷位,T2WI冠狀位)和DKI-SEM序列掃描。常規T1WI和T2WI掃描均采用自旋回波序列,層厚2 mm,層間距0.2 mm,視野100 mm×100 mm。DKI-SEM序列為單次激發平面回波擴散加權成像序列,層厚2 mm,層間距0.4 mm,視野176 mm×295 mm,TR 5 000.0 ms,TE 75.0 ms,帶寬1 405 Hz/像素,掃描矩陣118×198;所用6個b值(激勵次數)為0 (1)、500 (2)、800 (3)、1 000 (4)、1 500 (6)和2 000 (6) s/mm2[9,13],每個非零b值均采用3個相互正交的擴散編碼方向,并行采集加速因子為2。

圖像后處理和測量 掃描完成后,將瘤鼠的DKI-SEM原始DICOM圖像導入電腦,使用基于Mathworks的 MATLAB軟件編寫的圖像處理程序,利用高斯濾波器以3 mm的半高全寬值抑制擴散加權圖像的噪聲[14]。分別根據以下模型對逐個體素進行DKI和SEM信號擬合獲得各參數圖:S(b)/S(0)=exp(-b·MD + 1/6·b2·MD2·MK);S(b)/S(0)=exp[-(b·DDC)α][5]。其中,S(b)代表擴散加權因子為b時的信號強度;S(0)代表無擴散加權因子時的信號強度。平均擴散系數(mean diffusivity,MD)表示校正非高斯運動后的表觀擴散系數(apparent diffusion coefficient,ADC)值;平均峰度(mean kurtosis,MK)反映水分子運動偏離高斯分布的程度;擴散分布指數(distributed diffusion coefficient,DDC)代表組織平均擴散速率;α是擴散異質性指數,描述組織內水分子擴散的不均勻性[5]。傳統單指數擴散模型所產生的ADC由圖像處理程序自動生成。在對瘤鼠模型分組和組織病理學結果均不知情的情況下,2名分別具有12年和25年肝臟MRI診斷經驗的醫師對圖像進行后處理分析和評價:先在T2WI橫斷位圖像上選取腫瘤最大徑層面、測量腫瘤最大徑以獲得腫瘤大小[4],然后參照T1WI和T2WI橫斷位圖像,避開出血區域,分別在ADC圖像上于腫瘤最大徑層面沿腫瘤邊緣手動勾畫感興趣區(region of interest,ROI)[4,14],再自動拷貝到DKI和SEM各參數圖上(圖1、2)。每個觀察者在同一腫瘤同一層面上測量2次,結果取平均值,1個月后重復該項操作。將具有25年診斷經驗的醫師2次得到的均值再次平均獲得最終結果,用于后續的統計學分析。

組織病理學檢查 MRI掃描結束后處死瘤鼠,取下腫瘤連同肝臟放入10 %緩沖甲醛溶液中固定24 h。根據DKI和SEM掃描層厚度,取腫瘤中央約2 mm組織進行石蠟包埋,薄切為3 μm厚度的切片后染色。由具備10年診斷經驗的病理科醫師使用Aperio ScanScope和Leica SCN400對組織病理學切片行全景掃描后導出數字化圖像,使用SlidePath Gateway Client軟件對這些圖像進行觀察、放大、攝片、并以JPG格式保存,然后再將JPG圖像導入ImageJ(V1.48)和Image-Pro Plus(V6.0)軟件后獲得組織病理學結果。首先行HE染色顯示腫瘤整體、細胞和組織的形態及結構,經全景掃描獲得的原始數字化圖片(腫瘤中央切面)轉換成JPG圖片后,再通過ImageJ軟件轉換成灰階圖,后者中每個像素均附有對應的灰度值,接著對圖片進行直方圖分析獲得像素灰度的分布情況,然后測量得到反映腫瘤空間異質性的指標即標準差(standard deviation,SD)和峰度[15-18]。其次,將HE染色的腫瘤圖像放大20倍后隨機取5個區域計算得到壞死分數(necrotic fraction,NF),NF為視野內腫瘤壞死面積/視野內腫瘤面積[19]。行抗CD31染色以獲取腫瘤內微血管密度(micro-vessel density,MVD),即先將抗CD31染色腫瘤圖像放大4倍,找到3個抗CD31染色陽性血管最密集的區域,然后放大20倍進行血管計數,得到腫瘤最大微血管密度[4]。行抗Ki-67染色觀察腫瘤內細胞增殖情況,在抗Ki-67染色腫瘤圖像上隨機選取5個區域放大20倍后計算陽性細胞數占比,得到Ki-67指數[20]。

Transverse T2WI shows the greatest dimension of a tumor (A).ADC map for ROI outlining the tumor (B).Images of MK map (C),MD map (D),α map (E) and DDC map (F) of the tumor (MK=1.170,MD=0.622×10-3mm2/s,α= 0.795,DDC = 0.493×10-3mm2/s).HE staining image shows patchy and irregular necrosis (G,black arrows,10×) in the tumor.Anti-CD31 and anti-Ki-67 immunohistochemistry images show intratumoral micro-vessels (H,black arrows,20×) and Ki-67 positive cells (I,black arrows,20×) in the tumor.

圖1 B組(第28天) HCC瘤鼠DKI和SEM各參數圖和組織病理學切片
Fig 1 DKI and SEM images and corresponding histopathological images of a nude mouse with xenograft HCC of group B (on the 28thday)

Transverse T2WI shows the greatest dimension of a tumor (A).ADC map for ROI outlining the tumor (B).Images of MK map (C),MD map (D),α map (E) and DDC map (F) of the tumor (MK=1.250,MD=0.684×10-3mm2/s,α=0.780,DDC=0.543×10-3mm2/s).HE staining image shows massive necrosis (G,black arrows,10×) in the tumor.Anti-CD31 and anti-Ki-67 immunohistochemistry images show intratumoral micro-vessels (H,black arrows,20×) and Ki-67 positive cells (I,black arrows,20×) in the tumor.

圖2 E組(第49天) HCC瘤鼠DKI和SEM各參數圖和組織病理學切片
Fig 2 DKI and SEM images and corresponding histopathological images of a nude mouse with xenograft HCC of group E (on the 49thday)

結 果

裸鼠原位HCC模型各組掃描結果 DKI-SEM掃描在25只瘤鼠中均順利完成,各參數圖中腫瘤均顯示清晰,各參數的觀察者內和觀察者間測定的一致性良好(ICCs=0.897-0.947)。各組中共有5只瘤鼠(B組1只,C組1只,D組1只和E組2只)肉眼可見腫瘤內出血,但均未發生于腫瘤測量層面。

裸鼠原位HCC模型各組間DKI和SEM各參數的比較 各組間MK、MD、α和DDC值差異均有顯著統計學意義(表1)。腫瘤MK值隨時間延長逐漸上升,種植瘤生長至第49天(E組),MK值下降;其中,D組MK值明顯高于A組和B組(Z=-2.410和-2.410,P=0.016和0.016),E組明顯低于D組(Z=-2.417,P=0.016)。腫瘤α值隨時間延長逐漸降低,但在E組有所升高;其中,D組明顯低于A組和B組(Z=-2.522和-1.991,P=0.012和0.047),E組顯著高于D組(Z=-2.200,P=0.028)。B組腫瘤MD和DDC值較A組略有下降,但未見統計學差異,而C組至E組的MD和DDC值逐漸上升;其中,D組顯著高于B組(MD:Z=-2.095,P=0.036;DDC:Z=-1.997,P=0.046),E組顯著高于B組和C組(MD:Z=-2.200和-2.200,P=0.028和0.028;DDC:Z=-2.402和-2.095,P=0.016和0.036)。其余組間腫瘤MK、MD、α和DDC值均未見統計學差異。

表1 裸鼠原位HCC模型各組間DKI和SEM各參數的比較
Tab 1 Comparisons of DKI and SEM parameters of nude mice with xenograft HCC among different groups

GroupMKMD (×10-3mm2/s)αDDC (×10-3mm2/s)A (21st d)1.182±0.0490.677±0.0150.813±0.0080.517±0.017B (28th d)1.200±0.0300.642±0.0260.799±0.0130.495±0.017C (35th d)1.240±0.0230.651±0.0210.794±0.0180.511±0.025D (42nd d)1.279±0.0250.670±0.0170.766±0.0180.526±0.017E (49nd d)1.200±0.0410.686±0.0170.804±0.0150.539±0.017χ212.44811.26110.6479.711P0.0140.0240.0310.046

HCC:Hepatocellular carcinoma;DKI:Diffusion kurtosis imaging;SEM:Stretched exponential imaging;MK:Mean kurtosis;MD:Mean diffusivity;DDC:Distributed diffusion coefficient.

裸鼠原位HCC模型各組間腫瘤大小和組織病理學指標的比較 裸鼠原位HCC腫瘤不斷增大,B組和C組明顯大于A組(Z=-2.660和-2.635,P=0.008和0.008),D組明顯大于A組和B組(Z=-2.627和-2.333,P=0.009和0.020),E組明顯大于A、B、C和D組(Z=-2.627、-2.643、-2.009和 -1.997,P=0.009、0.008、0.045和0.046)。SD和峰度值在B、C和D組逐漸升高,在E組則有所降低;其中,C組顯著高于A組(SD:Z=-2.193,P= 0.028;峰度:Z=-2.193,P=0.028),D組顯著高于A、B和C組(SD:Z=-2.611、-2.611和 -2.193,P=0.009、0.009和0.028;峰度:Z=-2.611、-2.611和-2.611,P=0.009、0.009和0.009),E組顯著低于D組(SD:Z=-2.611,P=0.009;峰度:Z=-2.611,P=0.009)。隨時間延長,HCC腫瘤的NF、MVD和Ki-67指數均有所升高,各組間比較差異均具有統計學意義(表2)。C組NF明顯大于A組和B組(Z=-2.611和-2.611,P=0.009和0.009),D組明顯大于A、B和C組(Z=-2.611、-2.611和 -2.402,P=0.009、0.009和0.016),E組明顯大于A、B、C和D組(Z均=-2.611,P均=0.009)。D組和E組的MVD明顯高于A組(Z=-2.227和-2.627,P=0.026和0.009)。C組的Ki-67指數明顯高于A組(Z=-2.402,P= 0.016),D組和E組的Ki-67指數明顯高于A組和B組(D組:Z=-2.611和-2.611,P=0.009和0.009;E組:Z=-2.611和-2.611,P=0.009和0.009)。

表2 裸鼠原位HCC各組間組織病理學指標的比較
Tab 2 Comparisons of histopathological results of nude mouse xenograft HCC among different groups

GroupSDKurtosisNF (%)MVDKi-67 index (%)Tumor size (cm)A (21st d)15.804±0.699(-9.346)±2.15811.643±1.20122.000±0.27415.934±0.9851.240±0.136B (28th d)16.153±0.758(-6.256)±2.36612.991±1.39722.400±1.09117.206±0.6751.660±0.080C (35th d)17.119±1.110(-1.350)±4.48719.272±1.61622.650±1.05618.975±1.4641.940±0.301D (42nd d)19.203±0.6064.103±0.81227.464±4.18223.817±1.00120.785±1.4382.000±0.200E (49th d)16.724±0.730(-5.507)±1.94739.529±1.30923.877±0.77321.162±1.3262.160±0.206χ214.55516.50522.16110.23417.17718.961P0.0060.002< 0.0010.0370.0020.001

SD:Standard deviation;NF:Necrotic fraction;MVD:Micro-vessel density.

裸鼠原位HCC模型DKI和SEM各參數與組織病理學各指標間的相關性 5組HCC腫瘤的MK值與SD和峰度值呈高度正相關(P均=0.001),α值與SD和峰度值呈高度負相關(P均=0.001)。5組腫瘤的MK和α值與NF、MVD、Ki-67指數以及腫瘤大小未見明顯相關性;去除E組后,MK值與上述各指標均呈顯著中度正相關(P均<0.05),α值與上述各指標呈顯著中度負相關(P均<0.05)。5組腫瘤MD和DDC值與NF呈中度正相關(P均<0.05),與腫瘤大小則未見明顯相關性;去除A組后,二者與NF呈顯著高度正相關(P均=0.001),與腫瘤大小呈顯著中度正相關(P均<0.05,表3)。

表3 裸鼠原位HCC各組DKI和SEM各參數與組織病理學各指標間的相關性Tab 3 Correlations between DKI and SEM parameters and histopathological results of nude mouse xenograft HCC at different time points among groups

討 論

空間和時間異質性是腫瘤異質性的重要方面之一,與腫瘤發生、發展及治療過程中腫瘤內部不同成分的演變有關[3,22]。腫瘤空間異質性越高,預后越差[3]。腫瘤異質性在腫瘤的臨床診斷、治療和預后評價等方面具有重要價值。本研究發現DKI和SEM方法能夠一定程度上反映HCC的空間異質性,并監測到HCC自然生長狀態下,腫瘤異質性隨時間的延長而變化,與組織病理學指標相關。因此,DKI和SEM參數或許可以成為評價腫瘤時空異質性的生物影像學指標。

本研究發現隨時間的延長,腫瘤大小不斷增大,NF、MVD、Ki-67指數不斷升高。進一步分析腫瘤HE染色切片,發現在第28、35、42天,裸鼠原位HCC的SD和峰度值均有所升高,而在第49天,腫瘤的SD和峰度值降低。有研究者指出腫瘤的SD和峰度值越大,組織的空間異質性越大[17- 18]。本研究組織病理學檢查證實裸鼠原位HCC于自然生長狀態下從第21天至第42天腫瘤空間異質性增大,在第49天有所減小。

MK反映水分子運動偏離高斯分布的程度,MK為0時,水分子運動符合高斯分布。α值反映組織內水分子擴散的不均勻性,范圍為0～1,α越接近1說明信號衰減越接近單指數模型信號衰減。MK和α均與組織的復雜程度有關,MK值越高、α值越低代表組織異質性越大[13,23]。在乳腺癌的研究中,發現高級別腫瘤MK值明顯高于低級別腫瘤,腫瘤MK值與組織學分級和腫瘤增殖指標Ki-67指數顯著正相關[14,20];腫瘤直徑越大、Ki-67指數越高的腫瘤α值越小[24]。Ren等[25]對膠質瘤的研究發現高級別腫瘤的α值明顯低于低級別腫瘤,α值與腫瘤組織學分級和Ki-67指數存在顯著負相關。本研究在HCC模型中也發現了類似的結果,在去除第49天的E組后,腫瘤MK值與Ki-67指數和腫瘤大小中度正相關,α值與Ki-67指數和腫瘤大小中度負相關。同時,我們還發現MK和α值與NF、MVD之間也存在中度相關性。以上結果說明在HCC的生長早期,細胞增殖、血管生成以及區域性壞死是造成腫瘤異質性增大的主要因素[26]。但到第49天,腫瘤壞死面積逐漸增大(此時NF明顯升高),大面積及較均勻分布的壞死一定程度上使腫瘤空間異質性降低,表現為MK值下降和α值上升。與本研究結果相仿,Shi等[27]對裸鼠胃癌模型的研究也同樣發現在實驗觀察時間段內對照組腫瘤的MK值存在先上升后下降的趨勢。同時,我們還發現5組腫瘤的MK和α值與反映腫瘤空間異質性的組織病理學指標SD和峰度值間高度相關。因此,MK和α能夠反映HCC的腫瘤空間異質性,并可用于監測其隨時間變化的情況。

MD和DDC是反映水分子擴散的指標,與傳統DWI的ADC值存在相關性,能較ADC更準確地反映組織內水分子擴散情況[28]。隨著腫瘤細胞增殖、血管生成、腫瘤增大和細胞外間隙減小,在某一時間點,腫瘤達到最密實的狀態,此時MD和DDC值降低。之后隨著腫瘤的生長,腫瘤體積增大,其血管生成已經無法滿足細胞增殖和腫瘤生長的需要,瘤內壞死逐漸增多,使擴散系數MD和DDC值增大[12]。在去除第21天的A組后,我們觀察到MD和DDC值與NF之間的相關性較未去除A組前更大,達到高度正相關,并且與腫瘤大小中度正相關。本研究未發現MD和DDC值與腫瘤異質性指標SD和峰度、Ki-67指數和MVD之間的相關性,其原因可能是在觀察時間段內,MD和DDC并不是反映HCC的腫瘤異質性、細胞增殖和血管生成的敏感指標。

本實驗存在一些局限性。首先,為了更好地將DKI和SEM各參數與組織病理學相對照,我們選擇在腫瘤最大徑層面上測定,因此對腫瘤整體異質性的反映有限[29],且病理切片與DKI和SEM圖像可能不完全匹配。第二,盡管我們勾畫ROI時避開了出血區域,但MRI上肉眼不能分辨的微出血的存在可能對結果產生一定影響。第三,每個時間點的瘤鼠只有5只,樣本量較少,未來需要擴大樣本量來進一步驗證本研究結果。最后,本實驗所研究的DKI和SEM參數可能僅反映了HCC腫瘤異質性的某些方面,最近一項基于血氧水平依賴和動態增強MRI的直方圖分析也發現能夠定量分析HCC腫瘤異質性,但技術更復雜、耗時更長[30]。

綜上所述,DKI和SEM能夠一定程度上反映HCC自然生長狀態下隨時間的延長而變化的腫瘤空間異質性,或可成為臨床評價HCC腫瘤時空異質性的生物影像學指標。

doi:10.1002/jmri.26523.