人小細胞肺癌NCI-H446細胞成瘤組織中HSG及WNT/Ca2+信號通路相關基因表達△

吳閩付，陶金艷，葛正行

貴陽中醫學院研究生院，貴陽550021

小細胞肺癌占肺癌的15%～20%，其惡性程度極高，5年生存率僅為10%～20%[1]。小細胞肺癌對化療比較敏感，初治緩解率較高，但極易發生耐藥，由于小細胞肺癌細胞具有生長分數高、倍增時間短的特點，因此多數患者在確診時往往已發生遠處轉移。目前，臨床針對小細胞肺癌的治療仍不具有靶向性。但已有研究發現，細胞增殖抑制基因（hyperplasia suppressor gene，HSG）基因 、WNT/Ca2+信號通路與腫瘤的生長和轉移密切相關[2]，但目前針對其與小細胞肺癌關系的研究仍較少。本研究對小細胞肺癌中HSG基因及WNT/Ca2+信號通路關鍵基因的表達情況進行分析，旨在為臨床小細胞肺癌的基因靶向治療提供理論參考，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

裸鼠20只，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級，雌雄各10只，年齡為6～8周，體重為18～22 g，購自常州卡文實驗動物有限公司，合格證書[SCXK（蘇）2011-0003]。

1.2 試劑與儀器

Trizol總RNA提取試劑購自GenStar-Biosolutions公司，反轉錄試劑盒及擴增試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司，人小細胞肺癌NCIH446細胞購自齊氏生物科技有限公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計購自美國Thermo公司，實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）儀和聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀購自美國ABI公司，凝膠成像系統購自Bio-Rad公司。

1.3 細胞培養

將NCI-H446細胞靜置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h，隨后進行傳代，分別在含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養基中培養，取第2代NCI-H446細胞用于接種。

1.4 裸鼠成瘤

1.4.1 細胞接種將第2代NCI-H446細胞制成濃度為1×107/HP的細胞懸液，在100級實驗室內，用帶6號針頭的2.5 ml注射器取1 ml細胞懸液注射于裸鼠皮下，雙前肢腋下注射約0.2 ml[3-4]。

1.4.2 裸鼠腫瘤組織提取與鑒定接種后5天左右，接種部位表面可見一暗紅色突起腫瘤組織，拖頸處死裸鼠，切開腫塊皮膚取出腫塊，將腫瘤組織切成重量為50～100 mg的組織塊，隨機取腫瘤組織塊于10%中性福爾馬林固定液中固定，將標本送于貴陽中醫學院第二附屬醫院病理科進行病理鑒定。

1.5 HSG、WNT 5 A及WNT11基因表達水平的檢測

取50 mg腫瘤組織及50 mg距腫瘤組織1 cm的皮膚組織（癌旁組織），采用液相提取法提取腫瘤組織和癌旁組織總RNA，隨后對總RNA進行瓊脂糖電泳檢測其質量。將提取的總RNA逆轉錄成cDNA，逆轉錄體系：4 μl 5×Prime Script Buffe（rfor real time），1 μl Prime Script RT Enzyme Mix I，1 μl Oligo dT Primer（50 μmol/L），1 μl Random 6 mers（100 μmol/L），2 μl cDNA 模 板 ，9 μl Rnase Free ddH2O；反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；反應產物于4℃冰箱保存。按如下方法構建PCR反應體系：SYBR premix Ex Taq Ⅱ 10 μl，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.8 μl，PCR Reverse Prime（r10 μmol/L）0.8 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl，cDNA模板2 μl，Rnase Free ddH2O 6 μl。按兩步法設置反應條件：第一步，90℃30 s預變性，共1個循環；第二步，95℃5 s，60℃34 s，共40個循環。采用7500 Software v2.3軟件分析PCR結果。基因的相對表達量用ΔΔCt法表示，具體計算公式：成瘤組基因ΔCt=成瘤組基因Ct值-內參基因Ct值；對照組基因ΔCt=對照組基因Ct值-內參基因Ct值；ΔΔCt值=成瘤組基因ΔCt-對照組基因ΔCt；倍數變化采用 2-ΔΔCt表示，2-ΔΔCt＞1表示成瘤組基因表達水平高于對照組，2-ΔΔCt＜1表示對照組基因表達水平高于成瘤組，2-ΔΔCt=1表示兩組表達水平一致。

1.6 統計學分析

采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成瘤組織鑒定結果

20只接種NCI-H446細胞懸液的裸鼠中，1只裸鼠于操作過程中死亡，15只裸鼠成功成瘤，成瘤率為78.9%（15/19）。腫瘤組織在蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色下可見小于靜止期小淋巴細胞大小的腫瘤細胞，其形態具有圓形、卵圓形或梭形核，細胞質稀少，細胞核內染色質呈細顆粒狀，核仁缺乏或不明顯，細胞邊界不清，可見核切跡，核分裂數高（圖1）。成瘤組織病理學形態與NCI-H446細胞腫瘤病理學形態大致相同，說明造模成功。

圖1 裸鼠成瘤組織的病理切片（HE染色，×200）

2.2 基因擴展效率分析

取同一標準HSG、WNT5A、WNT11及β-actin基因的cDNA模板，進行1倍、10倍、100倍濃度稀釋，分別在同一擴展體系下進行基因擴展，結果顯示：HSG、WNT5A、WNT11及β-actin基因的擴展效率均為89.25%，r2=0.993；各指標均無引物二聚體以及非特異性擴增高峰的出現，引物設計合理，特異性較高。

2.3 HSG、WNT 5 A及WNT11基因的表達水平

以癌旁組織為對照，成瘤組織中HSG基因的相對表達量明顯降低，為（0.79±0.23），WNT5A、WNT11基因的相對表達量明顯增高，分別為（6.62±1.45）、（4.80±1.74），差異均有統計學意義（P＜0.01）。

3 討論

HSG基因由中國學者陳光慧發現，其編碼產物HSG/MFN2可以通過抑制ERK/MAPK信號轉導通路使細胞周期停滯在G0/G1期。HSG基因定位于人1號染色體短臂36.22，該區域易發生基因突變，出現異位或缺失[5]。相關研究表明，HSG基因通過影響線粒體融合度及活動性而參與細胞分化過程[6]。進年來，HSG基因作為一個抑癌基因逐漸被人們重視[7]。也有研究證明，HSG基因具有抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡的作用[8]。HSG基因與腫瘤轉移有關[9-11]。本研究結果顯示，成瘤組織中HSG基因的相對表達量明顯低于癌旁組織（P＜0.01），表明HSG具有抗腫瘤效應，可能為潛在的抑癌基因[12-13]，為小細胞肺癌的早期治療提供靶點。

WNT/Ca2+信號通路屬于WNT信號通路中的非經典通路之一，激活該通路的關鍵蛋白有WNT5A、WNT11，該通路被激活后可引起細胞內Ca2+濃度增加和Ca2+敏感信號成分的激活，以調節細胞黏著和細胞運動。WNT5A在各器官腫瘤發展過程中起到重要的作用，在各系統腫瘤組織中都有較高表達[14-15]。相關研究表明，WNT信號異常激活與拮抗基因SFRP的缺失或啟動子的甲基化導致基因沉默或表達下調有關[16]。本研究結果顯示，WNT5A、WNT11在成瘤組織中的表達水平明顯增高，表明WNT/Ca2+信號通路在成瘤組織中大量開放，并參與成瘤的過程。

綜上所述，HSG基因表達水平降低及WNT/Ca2+信號通路大量開放共同作用，可以促進小細胞肺癌細胞的生長及轉移。但本研究因受實驗經費影響，實驗樣本較小，未進行相關蛋白檢測，因此本實驗結果僅為后續相關實驗提供有限參考。