肝細胞肝癌(HCC)中PDGF-A的表達及其臨床意義

高瓊媚 劉丹陽 周仲文 張喬安 劉國元 曾文姣△

(1復旦大學基礎醫學院病理學系 上海 200032; 2復旦大學附屬婦產科醫院病理科 上海 200011;3復旦大學附屬華山醫院病理科,4皮膚科 上海 200040)

肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上第6位常見惡性腫瘤,占腫瘤致死率的第2位[1],同時也是我國最為常見的惡性腫瘤之一。HCC治療方法有多種,包括手術切除、化療、放療、肝臟移植等,但患者治療后存在著復發率高和耐藥現象,因此有必要進一步深入研究HCC發生發展的分子機制。

血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)是相對分子質量為28 000～35 000的多肽生長因子,主要促進間葉來源的細胞增殖、生存和遷移。PDGF-A是PDGF家族中重要的一員。在腫瘤的發生發展過程中,PDGF-A主要通過與其受體PDGFR-α結合,激活下游信號分子如PI3K/AKT、ERK、STAT、SHP2等,促進腫瘤細胞的增殖和侵襲[2]。最新的大數據分析顯示,與相應正常組織比較,包括HCC在內的多種腫瘤(如多形性膠質母細胞瘤、前列腺腺癌、胃腺癌等)組織中PDGF-A表達升高[3]。酪氨酸激酶抑制劑Sorafenib已被批準為晚期HCC臨床用藥。2016年的一項HCC隨機治療試驗[4]發現放療聯合Sorafenib減弱了PDGF反應,提示其主要作用機制可能是下調PDGF。臨床觀察發現部分手術后行干擾素α治療的患者,中途停藥后,HCC在短時間內復發;動物模型研究發現PDGF-A上調是HCC復發及干擾素α治療失敗的原因,聯合給予PDGF受體抑制劑可提高再治療的效果[5]。

雖然PDGF-A在腫瘤發生發展中的機制研究較多,但其在人HCC組織中的研究較少。少量文獻報道了PDGF-A在HCC中表達及臨床特點之間的關系,但僅采用免疫組化染色分析[6]。本研究在人HCC組織檢測了PDGF-A基因表達,分析其與BCLC分期的關系;檢測了7株肝癌細胞株PDGF-A蛋白質水平;運用免疫組化染色顯示組織中PDGF-A蛋白質定位;并首次應用免疫熒光雙重染色技術顯示4種炎癥細胞(CD4+、CD8+、CD19+、和CD68+細胞)可以表達PDGF-A。

材 料 和 方 法

組織標本 選取2010—2011年在復旦大學附屬中山醫院肝臟外科施行肝癌切除術的50例HCC標本,包括-80 ℃凍存的癌組織和癌旁肝組織,以及石蠟組織塊,患者臨床病理資料見表1。8例正常肝組織來源于該院肝血管瘤切除標本旁的非瘤正常肝組織,作為正常對照肝組織。另有5例HCC石蠟組織來源于復旦大學附屬華山醫院,用于免疫熒光染色。

巴塞羅那臨床肝癌(Barcelona Clinic Liver Cancer,BCLC)分期系統在臨床廣泛使用,根據腫瘤情況和臨床表現將肝癌患者劃分為5期(0、A、B、C、D期)[7]。因D期患者不進行手術治療,所以本研究標本來自于0至C期HCC患者。0期:單個腫瘤≤2 cm、膽紅素正常、無門脈高壓;A期:少于3個腫瘤且均≤3 cm、Child-Pugh A-B;B期:多于3個腫瘤、Child-Pugh A-B;C期:有血管侵犯或轉移、Child-Pugh A-C。

細胞株和培養基 Hep3B、SMMC-7721、MHCC97-H、BEL-7402肝腫瘤細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心,L02正常肝細胞和HepG2、Huh7、HCCLM3肝腫瘤細胞株獲贈于復旦大學肝癌研究所。所有細胞株均采用Gibco高糖DMEM培養基,37 ℃、5% CO2條件下培養,取對數生長期的細胞用于實驗。

定量RT-PCR檢測 組織總RNA用Trizol常規抽提,經甲醇變性瓊脂糖凝膠電泳,證實未有降解。逆轉錄采用PrimeScriPt RT試劑盒(日本Takara公司),按說明書操作。跨外顯子的引物和Taqman探針購自美國Applied Biosystems公司,包括內參TBP(Hs00427620_mL)和PDGF-A(Hs00964426_mL)。每個樣本做3個復孔,蒸餾水為空白對照。每個反應體系包含10 ng cDNA(1 μL),定量RT-PCR在ABI7900HT實時定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)上完成。用TBP基因標準化PDGF-A基因數據得到其相對表達值。

Western blot檢測 收集處于對數生長期的細胞,提取總蛋白、定量、SDS-PAGE分離、轉膜至PVDF膜。兔抗人PDGF-A抗體(1∶1 000稀釋,ab9701,英國Abcam公司) 4 ℃孵育過夜,辣根過氧化物酶HRP-羊抗兔IgG抗體(1∶1 000稀釋,SA00001-2,美國Proteintech公司)室溫孵育1 h,ECL試劑曝光顯色。內參選用兔抗β-tubulin抗體(1∶1 000稀釋,10068-1-AP,美國Proteintech公司)。

免疫組化染色及分析 5 μm石蠟切片,脫蠟,0.3%過氧化氫甲醇溶液去內源性過氧化物酶,檸檬酸緩沖液(pH 6.0)微波修復10 min,正常羊血清封閉。隨后,兔抗PDGF-A抗體(1∶50稀釋,sc-128,美國Santa Cruz公司)37 ℃孵育1 h,4 ℃過夜,HRP-羊抗鼠/兔IgG抗體 (稀釋比例1∶3,K5007,丹麥DAKO公司) 37 ℃孵育45 min,DAB顯色,蘇木精復染1 min,中性樹膠封片。

對癌細胞染色陽性程度進行半定量分析。染色強度分為:0,無染色/可疑著色;1,有確切著色;2,有明顯著色;3,強烈著色。陽性細胞數量分為:1,少量細胞(<30%);2,較多細胞(30%～60%);3,大量細胞(>60%)。兩者的乘積為該例癌細胞PDGF-A分值,設定<1分為陰性,1～3分為陽性,>3分為強陽性。

使用多光譜切片流式細胞儀(CLS140089,美國Perkin Elmer公司)配合拍照及分析軟件,對間質區域陽性細胞進行定量分析。每例選取癌和癌旁各5個×200視野拍照(Vectra 2.0.8);拆圖、建立光譜數據庫(Nuance 3.0.1.2);選出間質區域,計算陽性細胞占比(Inform 2.0.2)。視野的選擇:癌組織中的周邊部位為HCC代表(因該部位最能反映腫瘤的侵襲能力及惡性程度),同一切片上與癌組織稍遠的肝組織作為對照(避開直接與腫瘤接觸的區域)。

雙重免疫熒光染色 5 μm石蠟組織切片貼附于多聚賴氨酸預處理載玻片,脫蠟,0.3%過氧化氫甲醇溶液去內源性過氧化物酶,檸檬酸緩沖液(pH 6.0)微波高溫修復10 min,正常羊血清封閉非特異性結合,兔抗PDGF-A抗體(1∶50稀釋,sc-128,美國Santa Cruz公司)室溫1 h,HRP-羊抗鼠/兔IgG抗體(稀釋比例1∶3,K5007,丹麥DAKO公司)室溫10 min,熒光染料(OpalTM4-color試劑盒,NEL794001KT,美國Perkin Elmer公司)避光孵育10 min。隨后檸檬酸緩沖液(pH 6.0)微波10 min,洗去前面結合抗體。正常羊血清封閉,分別加鼠抗CD4、CD8、CD19或CD68單克隆抗體(1∶50稀釋,sc-32811、7188、69736、17832,美國Santa Cruz公司)室溫1 h,HRP-羊抗鼠/兔IgG抗體室溫10 min,熒光染料避光孵育10 min。DAPI室溫避光孵育10 min,甘油封片。在多光譜切片流式細胞儀上觀察及拍照。

統計學分析 應用SPSS 22.0軟件進行統計分析,獨立樣本t檢驗比較組間差異,配對樣本t檢驗比較腫瘤和相應瘤旁組織的差異。P<0.05為差異有統計學意義。

表1 HCC患者的臨床病理特征統計數據Tab 1 The pathological features of patients with HCC (n)

結 果

PDGF-A mRNA水平及其與BCLC臨床分期關系 采用定量RT-PCR方法,檢測8例正常肝組織、50例HCC及相應癌旁非腫瘤肝組織中PDGF-A mRNA水平。28例HCC癌組織PDGF-A基因表達高于正常肝組織平均值,其中19例是正常肝組織均值的2倍及以上。與相應癌旁組織相比,HCC癌組織PDGF-A基因表達升高(P<0.01,圖1A),其中24例HCC癌組織表達量是癌旁組織的2倍及以上。分析各BCLC分期病例,PDGF-A的mRNA在各期的癌組織均較癌旁組織高,其中0、C期的差異有統計學意義(P<0.01,圖1B)。

A:PDGF-A mRNA levels in normal livers (n=8),HCC and corresponding adjacent livers (n=50).B:PDGF-A mRNA levels in normal livers (n=8),HCC with BCLC 0 stage (n=6),A stage (n=25),B stage (n=13) and C stage (n=6).NL:Normal liver tissue;Adjancent:Adjancent liver tissue;(1)P<0.01.

圖1 正常肝、HCC及其相應癌旁肝組織的PDGF-A mRNA水平
Fig 1 PDGF-A mRNA levels in normal livers,HCC and corresponding adjacent liver tissues

肝腫瘤細胞株中PDGF-A蛋白質水平 運用Western blot方法檢測正常肝細胞株L02和7株肝腫瘤細胞中PDGF-A蛋白質水平,結果如圖2。 L02、SMMC-7721、HCCLM3、MHCC97-H細胞株中表達PDGF-A蛋白質,其水平在MHCC97-H細胞中最高,其次是SMMC-7721,然后是HCCLM3和L02。另4株細胞未檢測到PDGF-A蛋白質,包括HepG2、Hep3B、Huh7和BEL-7402細胞。

PDGF-A protein is detected in L02,SMMC-7721,HCCLM3 and MHCC97-H cell lines;while HepG2,Hep3B,Huh7 and BEL-7402 have no detectable PDGF-A protein.

圖2 正常肝及肝癌細胞株中PDGF-A蛋白質水平
Fig 2 PDGF-A protein levels in liver cell and hepatoma cell lines

PDGF-A在HCC組織中的分布及表達 在HCC組織石蠟切片上進行的免疫組化染色顯示,PDGF-A蛋白質陽性染色存在于肝癌細胞和間質炎癥細胞中(圖3)。癌細胞中PDGF-A蛋白質分布有2種類型:彌漫分布于細胞質內(圖3D),在細胞質/細胞膜局部聚集(圖3E、F)。對癌細胞染色陽性程度進行半定量分析顯示,癌細胞PDGF-A蛋白質陽性表達見于33.3% (14/42)的病例,強陽性表達見于26.2% (11/42)的病例,其余40.5% (17/42)病例無/極微弱表達。

PDGF-A在HCC組織間質炎癥細胞中的表達分析 運用圖像分析技術定量測定間質中PDGF-A陽性細胞百分比,HCC癌間質區域PDGF-A陽性率(67.0%)高于相應的癌旁肝(18.3%),差異有統計學意義(P<0.0001,圖4A)。BCLC各期病例分析均顯示,HCC癌間質區域PDGF-A陽性率高于相應的癌旁肝間質區域,差異有統計學意義(P<0.05,圖4B)。

CD4+、CD8+、CD19+和CD68+炎癥細胞表達PDGF-A 為明確組織間質中PDGF-A陽性細胞的類型,運用免疫熒光雙染色技術,檢測4種免疫細胞標志物(CD4、CD8、CD19、和CD68)與PDGF-A的共定位 。PDGF-A蛋白質與CD4、CD8、CD19、和CD68均有共表達(圖5),表明CD4+、CD8+、CD19+和CD68+的炎癥細胞均可以表達PDGF-A。

PDGF-A positive staining exists in HCC tumor cells and interstitial inflammatory cells.A and B:The junction between tumor and surrounding tissue.C:Positive staining of inflammatory cells in tumor interstitium.D:PDGF-A is diffusely distributed in the cytoplasm of tumor cells.E and F:PDGF-A aggregates in local cytoplasm and/or cell membrane (Scale bar:50 μm.Original magnification A-B 200×,C-F 400×).

圖3 HCC組織中PDGF-A蛋白質的分布
Fig 3 PDGF-A protein distribution in HCC tissues

A:Percentage of PDGF-A positive cells in tumor interstitium is higher than that in corresponding adjacent liver interstitium (n=43).B:In all stages,interstitial PDGF-A positive percentages are higher in tumor than that in corresponding adjacent liver.(1)P<0.05,(2)P<0.000 1.

圖4 HCC間質中PDGF-A陽性細胞比例
Fig 4 Percentage of PDGF-A positive cells in HCC interstitium

Immunofluorescence double staining shows that CD4,CD8,CD19 and CD68 positive cells (red) have PDGF-A expression (green),respectively.Scale bar:50 μm.Original magnification 400×.

圖5 HCC組織中PDGF-A與CD4、CD8、CD19和CD68共表達
Fig 5 Co-expression of PDGF-A with CD4,CD8,CD19 and CD68 in HCC tissues

討 論

PDGF-A是功能最強的生長因子之一,通過自分泌或旁分泌調節,對多種腫瘤的進展至關重要,并與患者不良預后相關[3,8-9]。本文運用定量RT-PCR檢測了人HCC組織中PDGF-A的mRNA,發現其在癌組織中的表達水平高,近50%(24/50例)的癌組織PDGF-A基因表達量是癌旁組織的2倍及以上,尤其在早期和進展期(BCLC 0和C期)的HCC病例中。因本文病例較少,PDGF-A是否在HCC早期促進腫瘤的生長,在HCC晚期促進腫瘤侵襲轉移,尚有待更多的實驗數據驗證。

雖然HCC屬于PDGF及其受體基因缺陷發生率低的腫瘤[10],但有多篇文獻顯示PDGF-A在HCC癌組織中表達升高。運用高密度寡核苷酸陣列檢測38例HCV相關HCC,發現與正常肝組織相比,癌組織PDGF-A基因表達高[11]。國內學者[6]運用免疫組化研究了44例HCC患者,發現癌組織表達PDGF-A高于相應的癌旁和正常肝組織,且低分化者高于高分化者,伴門靜脈癌栓者高于無門靜脈癌栓者,提示PDGF-A與腫瘤的增殖分化及浸潤轉移有關。對PDGF-A受體PDGFR-α的研究顯示,雖然該受體基因表達整體下調,但其蛋白質水平在人HCC中顯著高于癌旁肝組織,其過表達促進腫瘤進展和預示患者預后差,可作為預后指標和治療的靶點[12]。

本文檢測了培養的肝癌細胞株中PDGF-A蛋白質,發現其表達于3株肝癌細胞株(MHCC97-H、SMMC-7721、HCCLM3)以及L02肝細胞株(人胚胎肝細胞)。MHCC97-H是復旦大學附屬中山醫院建立的高侵襲轉移肝癌細胞株,動物模型肺轉移率達100%[13],之后又從該細胞系得到更高轉移潛能的HCCLM3細胞系[14]。SMMC-7721來源于我國1名50歲男性原發性肝細胞肝癌,生長較迅速且較穩定,免疫缺陷小鼠體內成瘤率高[15]。4株細胞(HepG2、Hep3B、Huh7和BEL-7402)在本實驗條件下未檢測到PDGF-A蛋白質,其中3株細胞系屬分化程度高的肝腫瘤:HepG2是從阿根廷1名15歲高加索男孩的原發性肝胚細胞瘤中分離出并建立的,低轉移,在裸鼠中成瘤率較差;Hep3B分離自8歲美國黑人男童的肝癌組織,在裸鼠中能致瘤,但基本不轉移;Huh-7是從1名57歲日本男性肝癌組織標本上培養而得,高度分化[16]。

本文的免疫組化結果顯示HCC組織中PDGF-A有多個來源,一是癌細胞本身表達,二是腫瘤間質區域和緊鄰癌組織的間質區域的炎癥細胞。近60%病例的肝癌細胞表達PDGF-A,陽性染色有兩種分布方式:彌漫于胞質內,在細胞質/細胞膜局部聚集。這兩種分布形式在其發揮功能中是否有差異,尚需進一步研究。腫瘤間質區域和緊鄰癌組織的癌旁間質區域的大量炎癥細胞PDGF-A陽性,提示HCC癌細胞不僅可以接受本身PDGF-A的自分泌刺激,也可能接受來源于鄰近組織間質炎細胞分泌PDGF-A的旁分泌刺激。有文獻報道PDGF家族分子與腫瘤微環境中免疫細胞之間相互作用。PDGF-D可結合腫瘤微環境中活化的自然殺傷細胞,促其分泌干擾素γ、腫瘤壞死因子α等促炎因子和趨化因子,激活免疫應答,誘導促炎反應,限制癌細胞在體外和體內的生長[17]。PDGF-B可負向調節jumonji域蛋白6的表達水平,從而促進T細胞衰竭[18]。目前尚無HCC微環境中PDGF-A與免疫細胞之間關系的研究報道。

生理情況下,PDGF主要表達于血小板α顆粒內。當肝損傷發生時,PDGF可高表達于巨噬細胞、受傷的內皮細胞和激活的肝星狀細胞[19]。已有文獻報道人肝病組織內PDGF-A表達的細胞類型。Malizia等[20]在因多種疾病而進行肝移植患者的肝組織中,運用原位雜交技術顯示PDGF-A mRNA在單個核細胞和增生小膽管細胞大量表達,也表達于血管內皮細胞和平滑肌細胞,且通過連續切片的CD68免疫組化染色,證明巨噬細胞表達PDGF-A mRNA。Pinzani等[21]研究顯示,正常人肝中PDGF-A表達很少,而肝硬化組織PDGF-A表達顯著增加,免疫組化顯示其分布于硬化結節的血竇結構,原位雜交顯示其主要位于肝細胞和增生小膽管,也出現在纖維間隔內間質細胞,偶爾出現在纖維間隔和硬化結節內浸潤的炎癥細胞中。目前尚無文獻關注HCC組織中PDGF-A在癌細胞以外的細胞表達。本文首次應用免疫雙熒光染色技術顯示4種炎癥細胞(CD4+、CD8+、CD19+和CD68+細胞)可以表達PDGF-A,不僅提示多種間質炎細胞能通過分泌PDGF-A影響HCC細胞,也為后續HCC免疫微環境的研究提供了線索。