沼液微生物燃料電池的產電及有機物降解特性研究

王 芳，張德俐，陳 梅，易維明

（山東理工大學農業工程與食品科學學院；山東省清潔能源工程技術研究中心，淄博 255049）

0 引 言

近年來中國大型沼氣工程迅速發展，隨著沼氣工程的急速發展，大量沼液積累。由于發酵沼液仍具有較高濃度的有機質含量，而且成分復雜[1]，如果處理不當，將嚴重威脅生態環境。目前沼液處理方式主要有 3種，一是還田利用，二是曝氣好氧處理，三是生態處理。國外發達國家對沼液的處置方式主要是還田利用，但是對于中國來講，農村人均耕地較少，種養殖脫節嚴重，有相當一部分沼氣場周圍農田很難消納所產沼液，不得不采用生態處理或曝氣好氧方法對沼液進行后處理，以滿足環保排放要求[2]，但是這種處理方式，耗能巨大，經濟成本高。由于沼液中含有較高化學需氧量（chemical oxygen demand，COD）、氨氮、抗生素等，如果不加處理直接排放或還田，容易造成環境二次污染。

微生物燃料電池（microbial fuel cell，MFC）可以利用微生物降解可溶解的復雜有機物，獲得電能[3]。多種基質已被用于MFC的研究中，包括一些單一基質例如醋酸鹽、葡萄糖和一些復合基質等。目前，研究最為廣泛的復合基質包括：各類污水及木質纖維素類生物質。例如，啤酒廠廢水[4-5]與果汁加工工廠廢水等[6]。由于食品工業廢水中含有大量有碳水化合物，例如糖類、脂類等，是MFC底物有機質很好的來源，所以此類物質非常適合于作為MFC的陽極底物[7]。

發酵沼液作為有機廢水的一種，含有大量的糖類、揮發性脂肪酸及一些腐殖質，可以直接作為MFC中有機物底物來源。此外，沼液中還存在大量營養元素，例如氮、磷、鉀等微量元素，也是微生物代謝所必須的[8]。所以發酵沼液也可以作為MFC陽極底物加以利用，不僅可以產生電能，同時可以進一步降解沼液中的有機物質，使其達到減量化、無害化。同時，利用MFC處理發酵沼液廢水反應條件溫和，不需要能量輸入，無污染，反應可連續。本研究針對沼氣工程運行情況不同，所產沼液中有機物濃度不同，利用雙室MFC，探究了不同有機物濃度對沼液MFC產電性能及有機物去除效果的影響。同時通過對原料及MFC中陽極生物膜和陽極溶液中微生物多樣性與菌群結構分析探究MFC對沼液中有機物降解能力及產電的可行性。

1 試驗材料與方法

1.1 陽極底物與接種物

試驗所用沼液來源于山東理工大學厭氧發酵實驗室，將沼氣發酵后料液用 4層紗布過濾去掉較大固體殘渣，測定過濾后沼液COD質量濃度為（3618.6±55.6）mg/L，含有短鏈纖維素質量濃度為(882.5±59.2) mg/L，然后利用去離子水將沼液稀釋成不同的COD濃度，稀釋倍數分別為2倍、4倍、8倍，將其作為MFC反應器的陽極底物。接種物來源為山東理工大學校區內河溝污水，其COD質量濃度為106.6 mg/L。

1.2 MFC構型與操作過程

試驗中采用雙室構型MFC。由陰極室、陽極室、隔膜等部分構成。反應器上部及兩側分別留有取樣孔，以便對反應液采樣及陰極通入空氣。陰、陽極室分別采用8 cm×8 cm×8 cm正方體有機玻璃反應槽構成，利用硅膠墊及法蘭密封連接。中間的隔膜為Nafion117（Du Pont）質子交換膜，Nafion117膜為全氟磺酸聚合物質子交換膜，其厚度為183 μm，電導率為0.083 S/cm，質子交換膜在使用前需進行處理，其處理方法為：在30% H2O2溶液中，溫度為80 ℃，浸泡1 h，取出后，于去離子水中浸泡1 h，再在0.5 mol/L的H2SO4中浸泡1 h，在去離子水中清洗3次，每次10 min，最后保存在去離子水中備用[9]。陽極和陰極電極分別用5 cm×5 cm的正方形碳氈為基材，鈦絲作為導線制成，兩電極間距離為6.5 cm。MFC在正常運行時，兩極間接有恒定負載電阻，阻值為1 000 Ω。

在MFC第一周期開始前，向陽極反應器內加入過濾后新鮮沼液與接種物，其中接種物占總體積 35%，并按一定的體積比（5:1）加入金屬鹽類培養基（MSM）（表1），混合均勻進行MFC啟動。在試驗過程中，大約15 d左右完成一個產電周期，一個產電周期結束后，排出陽極原混合溶液的 70%，重新添加新鮮沼液。陰極溶液為50 mmol/L的鐵氰化鉀溶液，MFC運行過程中，每2～3 h向陰極室內通入空氣，并保持1 min。反應裝置置于環境溫度為20 ℃左右的室內運行。

表1 金屬鹽培養基（MSM）成分[10]Table 1 Composition of metal salt media (MSM)

1.3 試驗分析方法

1.3.1 產電特性分析

本試驗采用多通道數據采集卡（IN USB-6008，美國）進行電壓采集，利用 Labview 數據采集軟件對數據進行記錄保存，每隔2 min采集1次各路電壓值，每隔1 h對30組數據計算平均數，以每1 h獲得的平均電壓為最終值；極化曲線采用改變外電阻法獲得[11]。將MFC反應器外部連接可調變阻箱（ZX21型），外電阻阻值從1×104Ω調至 80 Ω，外電阻每調節一個阻值需要穩定 5 min后，再對電壓進行采集。極化曲線線性部分的斜率即為反應器的內阻。

本試驗中電流密度由歐姆定律計算。功率密度曲線為功率密度 P 隨電流密度的變化曲線。通常用功率密度曲線的最高點來表示系統獲得的最大功率[12]。

1.3.2 COD、纖維素測定與庫倫效率計算方法

本試驗通過監測沼液COD去除率考查MFC對發酵沼液無害化處理效果，COD測量的方法為重鉻酸鉀氧化法，利用多參數水質測定儀（LY-4DA型）進行測定。測量前分別取待測液 15 mL，用粗濾紙過濾，離心機（TGL-20）離心（6 000 r/min，5 min）后，進行測量，每組數據均測定3次，取其平均值。

發酵液中的纖維素為一般短鏈纖維素，可以被溶解，其測定方法為：取適量發酵液，用 4層紗布過濾去除較大顆粒與浮渣，準確量取100 mL于500 mL三角燒瓶中，加入20 mL濃HCl，于100 ℃沸水浴中加熱回流1 h，降溫至75 ℃后，加入1 mL冰醋酸和0.5 g亞氯酸鈉繼續恒溫加熱回流1 h。最后用經105 ℃干燥后恒質量的250 mL G4玻璃砂芯漏斗過濾，用200 mL熱水洗后，分別用10 mL 95%乙醇、甲苯、丙酮洗滌1次，取下過濾器用蒸餾水清洗外部后置于 105℃干燥箱中烘干至質量恒定[13]。

在MFC的研究中用庫倫效率（Coulombic efficiency，CE）衡量陽極的電子回收效率，定義為陽極有機物氧化轉化的實際電量和理論計算電量的比值[14]。CE按照下式計算。

式中M為氧氣的分子量，32 g/mol；t為時間，s；I為t時刻的電流，A；T為周期時間，s；n 為每摩爾氧氣被還原轉移的電子數；V為反應器容積，m3；F為法拉第常數，96 485 C/mol；COD0為起始COD濃度，mg/L；CODT為出水COD濃度，mg/L。

1.3.3 微生物群落多樣性及結構分析

本試驗采用 Illumina MiSeq測序平臺對玉米秸稈發酵沼液、接種物河溝污水及未稀釋沼液MFC中的陽極溶液和陽極碳氈的DNA樣品進行了分析，獲得其菌群結構。沼液MFC陽極溶液與陽極碳氈DNA樣品取自第4產電周期結束后。首先利用DNA提取試劑盒（Omega Biotec，美國）提取4種樣品中DNA，利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，確定PCR反應應加入的DNA量。然后對V3-V4區域進行16s rDNA擴增，所用引物為融合了 Miseq測序平臺的通用引物 341F引物(5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-barcode-CCT ACGGGNGGCWGCAG-3')和 805R引物(5'-GACTGGA GTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGG TATCTAATCC-3')，PCR擴增反應條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s 進行 5 個循環；94 ℃20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s進行 20 個循環；72 ℃ 5 min。第2輪擴增引入Illumina橋式PCR兼容引物，其反應條件為 95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s進行5個循環；72 ℃ 5 min。在25 μL PCR產物中加入體積6/10的磁珠（Agencourt AMPure XP，Beckman，美國）進行純化，并利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒（Life，美國）對回收純化后DNA精確定量，以方便按照1:1的等量混合后測序。最后將純化混合后樣品置于 Illumina MiSeq平臺進行測序，最后利用Prinseq等軟件和RDP數據庫（http://rdp.cme.msu.edu/misc /resources.jsp）、Silva數據庫（http://www.arb-silva.de/）等分析所得測序原始數據。

2 結果與分析

2.1 不同COD濃度沼液對MFC性能影響規律研究

2.1.1 不同濃度沼液MFC產電規律

在MFC系統穩定運行之前，需要經過啟動的過程，這一階段，是陽極底物中微生物群落在電池陽極定向選擇與富集的過程，啟動階段的電壓如圖1所示。在MFC未正常啟動時，其輸出電壓在一定時間范圍內，保持較低水平。在接種運行75 h后，以原沼液和稀釋2倍沼液為陽極底物的 MFC的輸出電壓開始穩步上升，在運行125 h后，其輸出電壓達到最大，隨后稍有降低后，保持基本穩定，分別為(302±29)、(232±18) mV。以稀釋4倍沼液為陽極底物的MFC，在接種運行100 h左右，其輸出電壓開始逐漸上升，大約在運行125 h后其輸出電壓達到最大并保持穩定，為(112±10) mV。而以稀釋8倍沼液為陽極底物的MFC，在接種運行后200 h一直保持較低電壓輸出，未能正常啟動。由此可以得出，即使在啟動階段，不同濃度底物的MFC輸出電壓值存在很大差異。此外，由于在陽極底物中存在較高比例的未分解的固形有機物質，所以與單一有機物質，如葡萄糖、乙酸等相比，產電啟動時間較長，同時整個產電周期持續時間較長[15]。

圖1 不同濃度沼液MFC啟動階段的電壓隨時間變化Fig.1 Start voltage output of MFCs with different concentration biogas slurry

圖2a－圖2d為外電阻1 000 Ω時，不同濃度沼液為陽極底物的MFC在4個產電周期內的電壓輸出情況。在MFC成功啟動后，每個產電周期內，產電趨勢大致呈快速上升，達到最大值后緩慢下降的過程，此過程大約持續15 d，所以在MFC正常運行過程中，每隔15 d左右需要重新注入新的料液。以原沼液與稀釋 2倍沼液為陽極底物的MFC，在成功啟動后的3個產電周期內，最大峰值較為接近，且能維持一段時間，證明MFC啟動成功且可以穩定運行。以稀釋4倍和稀釋8倍為底物的MFC，啟動后 3個周期產電峰值相差較大，且穩定時間較短，說明以此為底物的MFC運行穩定較差。其原因可能為，稀釋倍數過大，有機物含量較小，不能維持產電微生物持續分解利用產生電能。

圖2 不同濃度沼液MFC輸出電壓變化Fig.2 Voltage output of MFCs with different concentration biogas slurry

從圖3a功率密度曲線可以看出，原沼液、稀釋2倍、稀釋4倍、稀釋8倍沼液最大功率密度分別為203.4、60.8、36.6、3.2 mW/m2。Feng等[16]曾利用單室空氣陰極MFC，以不同濃度啤酒廢水為底物的產電試驗，發現MFC的最大功率密度隨廢水濃度的升高而線性增大。與本試驗結果一致，本試驗中沼液濃度與功率密度之間的線性擬合結果為y=0.0620x-29.234 8，R2=0.956 7（圖4）。但屈原津[17]利用以谷殼發酵液為底物的單室 MFC研究發現當底物質量濃度超過4 000 mg/L時，由于MFC系統中用來產電的微生物量有限，且隨著底物濃度增加，體系中有機酸含量上升，影響微生物的代謝活性，致使輸出電壓值降低。此現象在本試驗中沒有出現，說明以玉米秸稈發酵沼液為陽極底物的MFC體系中菌群結構合理，在較高COD濃度條件下可具有良好的產電性能。

圖3b為不同COD濃度玉米秸稈沼液的極化曲線，分別對歐姆極化區域進行線性擬合，其結果如表2所示，從R2可以看出，稀釋2倍與稀釋4倍沼液的線性擬合度較高。隨著有機物濃度的降低，內阻逐漸由261 Ω增大至1 822 Ω，致使其輸出功率受到影響。其原因為一方面由于去離子水將沼液稀釋，使溶液中電導率降低，從而增加了MFC的歐姆內阻[18]，另一方面，陽極底物濃度影響產電微生物活性，隨著底物濃度升高，微生物活性越強，轉移電子能力越強，輸出功率就越大[19]。本試驗中，以原沼液為陽極底物的雙室MFC內阻高于馮雅麗等[20]報道的以玉米秸稈發酵沼液為陽極底物的單室無膜空氣陰極MFC，其內阻為53～150 Ω，致使本試驗所得功率密度略低于該研究。但本研究MFC內阻要遠低于曹琳等[21]報道的以牛糞發酵沼液為陽極底物的單室無膜空氣陰極MFC，其最大功率密度為10.98 mW/m2，遠低于本研究。

圖3 不同濃度沼液MFC功率密度曲線和極化曲線Fig.3 Power density and polarization curves of MFCs with different concentration biogas slurry

圖4 玉米秸稈沼液濃度與最大功率密度的關系Fig.4 Relationship between biogas slurry concentrations and maximum power density

表2 不同濃度沼液MFC極化曲線線性擬合結果Table 2 Polarization curve fitting results of MFCs with different concentration biogas slurry

2.1.2 不同濃度沼液MFC有機物降解規律與庫倫效率

從不同濃度沼液MFC COD去除率及庫倫效率變化情況（表 3）看，COD去除率隨著稀釋倍數的增加而減小，除稀釋8倍沼液外，CE隨著稀釋倍數的增加而逐漸增加，其原因為，從外電路電壓輸出情況看，以稀釋 8倍沼液為陽極底物的MFC未能正常啟動，能量回收效率較低。由于在本試驗中，陽極底物停留時間較長，MFC 運行過程中擴散到陽極一定量的氧氣，有機物水解過程中有部分好氧菌作用，消耗能量，所以，本試驗以玉米秸稈發酵沼液為陽極底物的 MFC與其他原料為底物的MFC相比，CE較低，而且有機物含量越高，水解反應越強，所以沼液COD濃度越高，庫倫效率越低。因此需進一步改進MFC構型及運行條件，以獲得更高的能量回收效率。

經一個產電周期處理后，以原沼液為底物MFC陽極溶液中短鏈纖維素質量濃度為(289±56.4) mg/L，與未處理原沼液相比，其去除率為67.2%，由此可見，沼液中存在水解反應，纖維素等大分子有機物可被進一步降解。

表3 不同濃度沼液MFC COD變化情況和庫倫效率Table 3 COD changes and CE for different concentrations biogas slurry MFCs

2.2 微生物燃料電池陽極菌群結構分析

2.2.1 菌群多樣性分析

表4為4類樣品菌群多樣性分析（Alpha多樣性），反映微生物群落的豐度和多樣性，結果顯示MFC反應器中陽極碳氈中操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）數目略低于陽極溶液，皆與沼液OTU數目相差較小，且都高于河溝污水。ACE和 Chao是估計群落中含OTU數目的指數，Chao在生態學中常用來估計物種總數，其數值略高于所測得的樣品中的OTU數目。Shannon和Simpson指微生物多樣性指數，可以看出沼液中微生物Shannon指數最高，同時Simpson指數最低，說明沼液中菌群多樣性最高，菌群結構非常豐富；接種物河溝污水的Shannon指數最低，同時Simpson指數最高，說明河溝污水菌群多樣性最低。

表4 菌群多樣性分析Table 4 Diversity analysis of microbial communities

2.2.2 菌群結構分析

為了更好地分析原沼液、接種物、陽極溶液與陽極電極生物膜4類樣品微生物群落結構的聯系與差別，按照門、綱、屬3個等級進行分類，如圖5、圖6與表5所示。

圖5 4類樣品中主要菌門所占比例Fig.5 Distribution of main phyla in four samples

圖6 4類樣品微生物群落結構分布圖（以菌綱分類）Fig.6 Distribution of microbial community for four samples (class)

從圖6中4種樣品菌群結構來看，陽極溶液與沼液微生物菌群結構相似，其中沼液中存在最多的菌綱為Clostridia（36%），其次為 Bacteroidia（30%）、Synergistia（8%）、Flavobacteria（7%）、Spirochaetia（3%）。其中，Clostridia菌綱屬于Firmicutes菌門，可以產生纖維素分解酶，可將纖維素分解為糖、有機酸及醇類等小分子物質[22-23]，其在陽極溶液中約占 22%，在陽極碳氈生物膜上占 10%；Bacteroidia和 Flavobacteria屬于Bacteroidetes菌門，Bacteroidia可水解包括纖維素等復雜的有機物質[24-25]，在陽極溶液中占 39%，在陽極碳氈中占 20%；Flavobacteria廣泛存在與自然界泥土污水等，可分解碳水化合物產酸，在陽極溶液和陽極碳氈中均占5%左右。以上3種菌綱為MFC陽極中起到水解作用的主要菌群。Spirochaetia是一類廣泛存在于厭氧發酵中菌綱，可將糖類物質進一步水解為酸[26]，在陽極溶液中約占2.3%，它可將MFC中大分子物質分解為VFA。此外，原沼液中還含有 2%的 Betaproteobacteria與 1%的Gammaproteobacteria， Kim 等[27]研 究 表 明Betaproteobacteria和 Gammaproteobacteria菌綱可參與MFC的產電，由此可見沼液中也含有少量產電細菌，這2種菌綱在陽極溶液中占有量為3%～4%。由于沼液中產甲烷菌屬于嚴格專性厭氧菌，在試驗操作過程中，所用沼液經過取樣過濾等環節，與空氣接觸，所以使得所測沼液中攜帶的產甲烷菌含量很少，因此MFC中幾乎不含有產甲烷菌，不會與產電微生物產生底物競爭。如表 5所示，MFC陽極溶液中的水解細菌以 Cloacibacillus、Proteiniphilum、Clostridium和Sphaerochaeta等幾種菌屬為主，主要來源于發酵沼液，他們可將短鏈纖維素、淀粉和蛋白質等物質分解為小分子的糖和酸等，可為產電微生物提供直接分解底物[28]。

與沼液和陽極溶液相比，接種物河溝污水中菌群結構較為簡單，只含有 5類菌門，18類菌綱，其中Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria是接種物中三大主要菌門，分別占其微生物總量的 75%、16%和6%。與沼液菌群結構不同，接種物中Bacteroidetes菌門主要以 Flavobacteria為主，占該菌門 80%。在Proteobacteria下主要包含 4個菌綱分別為Betaproteobacteria（65%）、Gammaproteobacteria（24%）、Alphaproteobacteria（10%）、和 Deltaproteobacteria（1%）（圖6），且這4類菌綱均包含產電微生物[29]，在陽極碳氈生物膜上分別占微生物總量的11%、20%、8%和2%。有研究表明以葡萄糖和谷氨酸鹽為底物的MFC菌群中以Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria菌綱為主[27]；以醋酸鹽為底物的 MFC 的微生物群落以Deltaproteobacteria菌綱為主[30]，而在以復合生物質為底物的MFC中，幾種微生物的分布會隨著MFC運行時間和運行狀態的不同而有所不同[31]。

如表 5所示，在陽極碳氈生物膜上檢測到約 5%的Pseudomonas菌屬，屬于Gammaproteobacteria菌綱，它可以產生化學中介體綠膿菌素，可將電子轉移到電極[32]。此外，經過分析陽極碳氈中分布較多的菌屬還有Azotobacter、Solibacillus和Paracoccus 3類菌屬，分別約占陽極碳氈生物膜微生物總量的 12%、5.46%和 5.3%，分別屬于 Gammaproteobacteria、Clostridia和Alphaproteobacteria 3類菌綱，推測此3類菌屬可能參與玉米秸稈發酵沼液MFC的產電過程。在本試驗MFC中未檢測到文獻中廣泛報道的產電細菌 Shewanella 和Geobacter菌屬[25,33]，可能與接種物不同或所用陽極底物不同有關。除此之外，陽極生物膜上存在約 5%的Hydrogenophaga菌屬，主要來自接種物河溝污水，此類菌屬可消耗陽極產生的H2，降低沼液MFC產電性能，也是導致本試驗中MFC庫倫效率較低的原因之一。

表5 所測得主要菌屬在4類樣品中所占比例及所屬菌綱Table 5 Main genus consisted in four samples and their related class %

通過以上分析可知，玉米秸稈沼液MFC陽極溶液中菌群主要來源于沼液，以水解細菌為主；陽極碳氈生物膜上的微生物主要來源于接種物，以產電菌為主。試驗證明，以玉米秸稈發酵沼液為陽極底物的MFC菌群結構合理，MFC可以利用沼液中的水解細菌進一步分解沼液中的纖維素等大分子物質，同時可以富集接種物中的產電細菌，分解小分子有機物產生電能，避免VFA大量積累。來自于沼液中的水解細菌與來自于接種物中的產電菌在MFC體系中可以互利共生。所以在較高COD濃度條件下，MFC可持續產電，并未出現高濃度抑制現象。

3 結 論

1）通過對以不同化學需氧量（chemical oxygen demand，COD）濃度沼液為陽極底物的微生物燃料電池（microbial fuel cell，MFC）研究，當初始COD質量濃度為(3 618.6±55.6) mg/L時，其最大功率密度為 203.4 mW/m2，COD去除率可達63%，并且隨著沼液中有機物濃度降低，MFC運行穩定性越差，最大輸出功率密度成線性降低。

2）通過微生物菌群多樣性和菌群結構分析可知，MFC可以利用沼液中的水解細菌分解沼液中的纖維素等大分子物質，主要以 Clostridia、Flavobacteria和Bacteroidia菌綱為主，同時可以富集接種物中的產電細菌，分解小分子有機物產生電能，2類微生物可以互利共生。以玉米秸稈發酵沼液為陽極底物的MFC中菌群結構合理，并未出現高濃度抑制現象。

3）陽極生物膜中的主要產電菌屬為 Pseudomonas，約占MFC陽極生物膜微生物總量的5%，對于以秸稈類沼液為陽極底物的MFC，可人為接種或富集此類菌屬，以縮短MFC啟動時間，提高產電效率。