水熱法提取桑葉中異槲皮苷工藝參數優化

王星敏，王 露，李 鑫，詹 力，唐付杰

（1. 重慶工商大學環境與資源學院，重慶 400067；2. 重慶市特色農產品加工儲運工程技術研究中心，重慶 400067）

0 引 言

中國桑資源豐富，其葉約占桑樹地上部分產量的64%[1]。桑葉富含異槲皮苷、紫云英苷、葉黃素、谷甾醇等[2]多種天然活性物質及其衍生物，具有降血糖[3]、降血脂[4]、抗炎[5]、抗氧化[6]、抗腫瘤、抗菌[7]等藥理作用，是中國衛生部確定的藥食同源物。其中，異槲皮苷又稱為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷，屬黃酮類化合物，常作為天然著色劑、抗氧化劑等功能性原料[8]，廣泛應用于食品和醫藥行業。Jung等[9]發現異槲皮苷能有效降低由 NO引發的老鼠腦漿脂質的過氧化作用；Liu等[10]發現10 μmol/L的異槲皮苷通過抑制TNF-α，NO和iNOS的產生起到對多糖誘導 RAW264.7細胞產生炎癥因子的調控作用。目前對于異槲皮苷藥理性作用報道較多，對其提取的報道尚少。現有植物提取異槲皮苷的方法主要有超聲提取法、回流浸提法、酶法提取、超臨界流體萃取等。柯仲成等[11]采用回流法，100 g紅旱蓮經1 L/次乙醇回流2 h可提取異槲皮苷達2.83 mg/g；賈冬冬等[12]采用超聲提取桑葉中異槲皮苷和蘆丁，可提取異槲皮苷 6.47 μg/g。植物提提技術中，酶法[13]提取一般耗時至少3 h；超臨界流體提取技術[14]雖已應用于實際生產中，但對設備要求高，投資大。現有提取技術或多或少存在提取率不高、投資成本大、時間長等不足。隨著“健康中國 2030”、“國民營養計劃(2017-2030)”和“鄉村振興”國家戰略的實施，如何高值利用桑等生物質資源，提高天然活性成分的提取效率，滿足人們日益增長的健康保健需求實現，越來越引起人們的關注。

桑葉致密的植物組織結構形成天然屏障，阻礙異槲皮苷等天然活性成分的溶出。水熱反應是熱化學轉化過程，在較低溫度（亞臨界區），生物質主要發生水解反應，生成水溶性物質（大分子物質）。將水熱反應引入天然產物提取技術中，主要利用一定的水熱高溫（壓）條件對植物組織的裂解或轉化水解[15]，破壞植物組織致密結構，加速溶劑滲透、擴散，減少天然產物浸出的傳質阻力，有利于天然活性成分的高效提取。基于此，為提高異槲皮苷提取率，本文提出水熱反應輔助醇提法提取桑葉中異槲皮苷，利用響應面分析法優化獲得適宜的異槲皮苷提取參數，探明影響異槲皮苷提取的因素間交互作用，探究異槲皮苷傳質擴散規律，為桑葉資源高值利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

原料：桑葉由重慶市北碚區蠶桑研究院提供。試劑：無水乙醇（分析純），磷酸（分析純），乙腈（色譜純），重慶川東化工集團有限公司，異槲皮苷標準品（≥98%），成都普菲德生物技術有限公司。儀器：1260高效液相色譜儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）；CJF-0.05小型高壓反應釜（北京鞏義予華儀器有限公司）；臺式電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；高速粉碎機（北京開創同和科技發展有限公司）；傅里葉變換紅外光譜儀（美國 Nicolet 公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 水熱輔助乙醇提取桑葉中異槲皮苷

采摘新鮮桑葉經干燥、粉粹、過篩 0.18 mm后，分別稱取干燥桑葉粉末5.0 g于水熱反應釜中，按桑葉質量與乙醇溶液體積之比（料液比）為 1:3～1:7加入體積分數為30%～70%的乙醇，于120～160 ℃的烘箱中水熱反應40～80 min后（通過預試驗確定范圍），過濾，分別收集濾渣和濾液。濾液即含有異槲皮苷醇提液；濾渣集中收集后待二次利用。區別于水熱輔助乙醇提取法，乙醇浸提法按乙醇體積與桑葉質量比為 10:1加入體積分數為50%的乙醇，于45 ℃水浴搖床浸提5.0 g桑葉粉末120 min。

1.2.2 異槲皮苷的分析測定

1）標準曲線繪制。準確稱取10 mg異槲皮苷標品用乙醇定容至25 mL得濃度為0.4 mg/mL異槲皮苷標準溶液，準確移取0.5、1、2、4、6、10 mL定容至10 mL，得到質量濃度梯度為 0.02、0.04、0.08、0.16、0.24、0.4 mg/mL的標準使用液以待檢測。以濃度c對峰面積作圖，繪制異槲皮苷標準曲線回歸方程為Y=12 615X-31.658，R2=0.999 8，表明在濃度范圍0.02～0.4 mg/mL內線性關系較好，可用于試驗計算。根據標準曲線計算異槲皮苷質量濃度，進而計算桑葉中異槲皮苷溶浸量y，計算公式見公式（1）。

式中 c異槲皮苷濃度，mg/mL；v提取液體積，mL；m桑葉質量，g。

2）高效液相色譜分析。采用高效液相色譜法測定醇提液中異槲皮苷質量濃度，色譜條件為：色譜柱為Hypersil ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相是體積比為 20:80的乙腈和 0.5%磷酸水溶液；流速為1 mL/min；檢測波長為350 nm；柱溫為25 ℃；進樣量為10 μL；洗脫時間 30 min。

1.2.3 桑葉底物FTIR分析

采用衰減全反射模式測定桑葉的傅里葉變換紅外光譜，分析水熱反應后底物表面化學物質的官能團種類及其變化，測定波數為4 500～500 cm-1。

1.2.4 響應面分析法

在單因素試驗基礎上，采用 Box-Behnken設計，選取水熱時間、料液比、水熱溫度和乙醇體積分數為自變量，以異槲皮苷得率為響應值，設計4因素3水平的響應面分析試驗，響應曲面因素水平編碼（表1）。

表1 響應曲面因素水平與編碼Table 1 Response surface factor level and coding

2 結果與分析

2.1 影響異槲皮苷溶浸的水熱-醇提單因素試驗

2.1.1 水熱時間對異槲皮苷溶浸的影響

水熱反應有利于植物組織的轉化分解，水熱反應時間影響著植物組織官能團裂解及分解效果，影響異槲皮苷傳質溶浸。由圖1a可知，5.000 0 g桑葉當料液比為1:4、乙醇體積分數為50%、水熱溫度為160℃時，在水熱反應40～80 min范圍內，桑葉中異槲皮苷溶浸量先上升后下降，在60 min時達到最大值，為2.626 1 mg/g，對比乙醇浸提法反應2 h的溶浸量（0.071 0 mg/g），水熱輔助醇提法大大提高異槲皮苷的提取能效。分析原因在于，木質素主要由苯基丙烷結構單元通過C-O-C和C=C聯接而成，在水熱轉化過程中，以β-O-4型連接的木素結構單元更易斷裂，同時C-C也相對易斷裂，易發生脫水反應[16]，加大木質素水熱轉化生成較低分子的酚類單體或多聚體[17]，纖維素及半纖維素的長鏈分子轉化成可溶性的低聚糖和單糖等小分子[18]，從而破壞植物組織致密結構，有利于異槲皮苷溶出充分，提高異槲皮苷溶浸率，但過度延長水熱反應時間會增加能耗[19]。

2.1.2 料液比對異槲皮苷溶浸的影響

提取溶劑乙醇為親水性有機溶劑，能誘導非極性物質產生一定的極性，因電性作用可溶解含有 8個羥基的異槲皮苷。由圖1b可知，當水熱溫度為160℃、乙醇體積分數為50%、水熱時間60 min時，在料液比為1:3～1:7范圍內，異槲皮苷溶浸量隨著料液比的增加先增加后減少，在料液比為 1:6時異槲皮苷得率達到最大值為2.689 1 mg/g。分析原因在于，增大提取液用量，可適度增大水熱高溫（壓）條件的滲透壓力，有利于異槲皮苷在滲透壓和溶劑靜電的雙重作用充分溶浸并提取；但繼續增大提取劑用量，同時也增大乙醇與桑葉中其他活性成分的接觸、溶浸作用，導致異槲皮苷在溶浸過程中與其他活性成分產生競爭關系，不僅影響異槲皮苷的溶浸，還造成不必要的溶劑浪費[20]。

2.1.3 水熱溫度對異槲皮苷溶浸的影響

溫度升高可促使分子運動加速，增加溶劑分子和溶質分子的動能[21]。由圖1c可知，當水熱時間60 min、料液比為1:6、乙醇體積分數為50%時，在120～160 ℃范圍內，異槲皮苷溶浸量先增大后減小，在 140 ℃時達到最大值，此時異槲皮苷溶浸量為2.497 mg/g。分析原因在于，水熱反應體系中較高溫度可適度軟化表面細胞壁，而纖維素和半纖維素是糖類碳水化合物，熱穩定性相對低[22]，在升溫過程中發生表面水解[23]；此外，水熱反應體系中較高溫度可加速乙醇分子和天然活性分子異槲皮苷的動能，更利于異槲皮苷的擴散和溶出[24]；溫度繼續升高，同時也加快其他物質的溶出，影響異槲皮苷溶出擴散效率，且過高溫度還會影響天然成分的生物活性，破壞天然活性成分分子結構。

2.1.4 不同體積分數的乙醇對異槲皮苷溶浸的影響

在水熱反應中，物質的擴散還與溶液黏度相關[25]。由圖1d可知，當料液比為1:6、水熱溫度140 ℃、水熱時間60 min時，乙醇體積分數為30%～70%時，不同體積分數的乙醇對異槲皮苷得率的影響有所不同，當乙醇體積分數為 60%時，異槲皮苷溶浸量達到最大為3.087 9 mg/g。分析原因在于，乙醇和水均含有-OH，根據相似相溶原理，可溶解還有8個-OH的異槲皮苷；異槲皮苷雖在水中溶解度僅為25.9 μg/mL，但水可適度增加醇提體系滲透壓力，可加大底物表面與溶劑間濃度差，有助于醇溶性物質的充分擴散和溶出；乙醇體積分數偏低，有利于提高多糖、多肽等水溶性物質溶出量[26]，乙醇體積分數偏高時，則加大醇溶性物質如葉綠素、葉黃素、親脂性強的成分溶出，影響異槲皮苷的溶出效果。

圖1 單因素試驗Fig.1 Single factor test

2.2 異槲皮苷溶浸因素的響應面分析

2.2.1 回歸模型構建及顯著性檢驗

運用Design-Expert v8.0軟件建立的試驗設計及試驗結果見表2，對表2中試驗數據進行回歸分析，得出水熱時間（A）、料液比（B）、水熱溫度（C）、乙醇體積分數（D）與異槲皮苷得率（Y）之間的二次多元回歸方程見式（2）。

該回歸方程中4個一次項系數均為正值，表明4個因子對異槲皮苷得率都有協同作用[27]。對該模型進行模型系數顯著性檢驗和方差分析，結果見表3。

表2 RSM試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results of RSM

表3 方差分析及顯著性檢驗Table 3 Analysis of variance and test of significance

從方差分析可以看出：該方程P＜0.000 1，F=22.91，表明針對本試驗的響應目標值 Y所選用的模型具有很好的顯著性；失擬項表示模型預測值與實測值不擬合的概率，該模型中失擬項P=0.506 1＞0.05，說明試驗與該模型的差異程度不顯著，無失擬因素存在，影響極顯著；決定系數R2=0.958 2，表明約95.82%的異槲皮苷得率變異分布在所選取的4個因素中，總變異中僅有4.18%不能由該模型解釋，表明該模型擬合程度良好；校正系數表明試驗值與預測值間具有較高相關性，該模型擬合程度良好，可用此模型對水熱反應輔助醇提異槲皮苷進行得率的分析和預測。由F值檢驗可獲得影響桑葉異槲皮苷得率的主次因素為：水熱時間＞水熱溫度＞料液比＞乙醇體積分數。

2.2.2 水熱解因素響應面及交互作用分析

響應面和等高線能直觀地反映各因素的交互作用對響應值的影響[28-30]。以式（2）數學模型為基礎，應用Design Expert 8.0.6軟件編程，繪制響應值異槲皮苷得率與影響因素的三維關系圖。等高線的形狀反映交互效應的強弱大小，橢圓形表示交互作用顯著，而圓形則相反[31]。由圖2a～2d可知，2因素間的響應面圖均存在極值，AB、AC、BC和CD的等高線呈橢圓形，橢圓軸線與坐標軸之間有較大的角度，表明響應面中 2個影響因素的交互作用顯著；此預測結果與表 3中方差分析及顯著性檢驗所反映的結果一致。

圖2 交互作用對異槲皮苷得率的響應面圖Fig.2 Response surface diagram of interaction on yield of isoquercitrin

2.2.3 模型驗證

采取響應面分析優化的適宜工藝參數，即水熱時間為80 min、料液比為1:7、水熱溫度為154 ℃、乙醇體積分數為57%，分別取5.0 g桑葉進行平行試驗3次取平均值，相對標準偏差RSD=1.3%，說明響應曲面法得出的最優工藝參數具有重現性，且該模型對優化此工藝具有可行性；試驗浸提所得異槲皮苷平均得率為3.649 1mg/g，是乙醇浸提異槲皮苷得率（0.071 0 mg/g）的51倍。相比單因素試驗結果，優化所獲工藝參數中水熱時間、水熱溫度有所提高，但優化所獲得的異槲皮苷得率較單因素試驗值3.087 9mg/g提高了18.2%，顯著增加高附加值的天然活性物質的利用率。結果見表4。

表4 最佳方案驗證結果Table 4 Verification result of best scheme

2.3 異槲皮苷溶浸過程解析

2.3.1 異槲皮苷傳質擴散模型

天然產物提取的過程其實質為活性成分在植物體與溶劑間的傳質擴散作用。將底物桑葉視為多孔介質[32]，利用經驗公式 Webber-Morris動力學模型擴散方程[33-34]探究異槲皮苷在植物組織在水熱解轉化及乙醇同步提取作用下、由植物組織體內擴散至溶劑的過程。其中，Webber-Morris動力學模型擴散方程為

式中Kt溶劑內擴散速率常數，mg/(h1/2?mL)；qt為異槲皮苷t時刻濃度，mg/mL；C常數，反應邊界層厚度；t為水熱時間，min。

基于響應面優化獲得異槲皮苷溶浸的適宜條件，開展異槲皮苷溶浸濃度隨桑葉水熱反應時間的影響研究，并以qt對t1/2作圖（圖3），相關參數見表5。

圖3 水熱法溶浸異槲皮苷的qt-t1/2曲線Fig.3 qt-t1/2 curve of isoquercetin dissolved by hydrothermal method

表5 異槲皮苷傳質擴散模型參數Table 5 Parameters of mass transfer diffusion model of isoquercetin

從決定系數 R2可知，3階段的相關性較高，表明該模型可用于分析異槲皮苷的擴散過程。由圖 3可知，異槲皮苷溶浸擴散分為 3個階段：第Ⅰ階段為滲透溶浸階段，即溶劑向底物表面及內部滲透，并溶浸底物中有效成分；第Ⅱ階段為內部擴散階段，即溶浸的異槲皮苷以分子形態從植物顆粒內擴散遷移到固液界面上；第Ⅲ階段為固液擴散階段，即有效成分從植物體內向溶劑主體擴散，直至平衡。從圖可知，第Ⅱ階段呈直線增加，且不過原點，推測內部擴散為異槲皮苷溶出的關鍵步驟；第三階段為平緩的直線，表明異槲皮苷溶浸趨于平衡，且當水熱輔助醇提至少需80 min，5.000 0 g桑葉中異槲皮苷溶浸才趨于平衡。此外，從表5中可知，3個階段的反應邊界層厚度常數C值大小為CⅠ＜CⅡ＜CⅢ，呈逐漸增大趨勢，而擴散速率常數Kt隨著邊界層厚度C的增加而變小，說明邊界層厚度影響擴散速率，內部擴散不是唯一的速度控制步驟。

2.3.2 桑葉水熱解表面紅外分析

對比桑葉原料、水熱輔助醇提后桑葉底物和醇提后桑葉底物的紅外光譜圖（圖4）發現，經水熱反應輔助醇提法處理的桑葉底物在2 916 cm-1[35]處纖維素的C-H伸縮振動、1 417 cm-1處木質素結構支鏈中甲氧基、1 105 cm-1處的羧基中C-O伸縮振動、895 cm-1處的纖維素中典型的β糖甘鍵特征吸收峰消失，表明桑葉中木質素的苯基丙烷結構單元以及纖維素表面官能團分解；對比乙醇浸提后底物和桑葉原料，水熱反應后底物在1 245 cm-1處的木質素二芳基醚鍵C-O、1 060 cm-1處的纖維素吡喃糖環所含的醇 C-O伸縮振動[17]的特征吸收峰明顯減弱，而1 624 cm-1的C=C出現、表明桑葉中纖維素的多聚糖發生水解。這與水熱反應的選取條件有關，當水熱溫度為154 ℃＜250 ℃時，水熱反應主要以水解反應為主，生成單糖等水溶性大分子物質；而一定壓力使得溶劑密度增大，促使C-O、C-H、C=C鍵斷裂，有利于水解反應發生，促進木質素的三維結構解體。

圖4 桑葉底物紅外光譜圖解析Fig.4 Infrared spectra of mulberry leaves

3 結 論

1）采用水熱反應輔助醇提法提取桑葉中異槲皮苷的適宜工藝參數為：水熱時間為80 min、水熱溫度為154 ℃、料液比為1:7、乙醇體積分數為60%時，5.000 0 g桑葉中可溶浸3.649 1 mg/g異槲皮苷，該溶浸質量是乙醇浸提的51倍，較單因素試驗值3.087 9mg/g提高了18.2%，顯著增加高附加值的天然活性物質的利用率，符合當下經濟、環境效益。

2）采用響應曲面法進行二次回歸擬合，所得模型P＜0.01，表明該模型影響極顯著；4個影響因素與響應目標值 Y之間存在交互作用的影響，其影響程度分別為：水熱時間＞水熱溫度＞料液比＞乙醇體積分數。

3）內部擴散模型研究表明，異槲皮苷在反應體系中的擴散存在滲透、內部擴散和邊界擴散 3個過程，內部擴散不是唯一的速度控制步驟，擴散速率常數隨著邊界層厚度增加而變小。解析紅外光譜圖可知，羧基中 C-O伸縮振動特征吸收峰、C-H彎曲振動消失，O-H和 C-H的特征吸收峰減弱，表明水熱反應有助于桑葉木質素中苯基丙烷結構單元分解，促使纖維素表面水解反應發生，有利于提取物異槲皮苷的溶出。