精油對熟制雞胸肉中產氣莢膜梭菌抑制效果預測模型研究

李苗云，張佳燁，朱瑤迪，王小慧，趙改名，柳艷霞

（河南農業大學食品科學技術學院，鄭州 450002）

0 引 言

產氣莢膜梭菌（C.perfringens）在環境中無處不在，如在土壤、水、食品、動物、人類等都能發現該菌的存在。C.perfringens為革蘭氏陽性厭氧菌，因能分解肌肉和結締組織中的糖類而產出大量的氣體以及可以形成莢膜而得名，主要導致腹瀉、腹痛等食源性疾病，C.perfringens是引起食源性腸胃炎最常見的病原菌之一。烹飪后不適當的冷卻和不合適的貯存溫度條件是導致大多數疾病暴發的主要原因[1]。目前防止該菌引起疾病的方法主要為使用抗生素及合成藥物，但由于較多副作用出現，替代技術考慮在食品中使用天然抗菌化合物，例如香料和草藥[2-4]。

目前肉類食品中抑制C.perfringens生長的方法眾多，主要包括添加有機酸和有機酸鹽、細菌素、殼聚糖、植物提取物精油等，有機酸鹽（乳酸鈣、乳酸鈉、檸檬酸鈉和磷酸鈉鹽等）作為新型抑菌劑廣泛應用于C.perfringens的安全控制。Saeed等發現，檸檬酸鈉和二乙酸鈉混合液可以抑制C.perfringens生長[5]；在體外抑菌試驗中發現羅伊氏菌素、乳酸鏈球菌素、芽孢桿菌素等細菌素都可以抑制 C.perfringens的生長，但由于食品中內源性蛋白酶可以降解細菌素，所以體內效果不明顯[6]；殼聚糖可以減少雞肉介質中C.perfringens芽孢的數量[7]，植物精油中的綠茶提取物和冬季香薄荷精油也可以顯著抑制C.perfringens生長[8]。

香辛料不僅可以增加食品色、香、味，而且還對多種微生物具有廣譜的抗菌性，目前國內外已經有許多通過香辛料精油抑制微生物生長的報道，例如肉桂醛，丁香酚，異硫氰酸烯丙酯（allyl isothiocyanate, AITC）和香菜酚可以抑制肉毒桿菌，金黃色葡萄球菌，大腸桿菌O157：H7和鼠傷寒沙門氏菌的生長[9-12]。香菜酚[13]對許多食源性病原體如大腸桿菌，單核細胞增生李斯特氏菌，蠟狀芽孢桿菌，沙門氏菌和清酒乳桿菌的抗菌活性已得到充分研究[14-17]而目前，國內外關于香辛料精油對產氣莢膜梭菌的抑菌活性在肉制品中的應用方面的研究較少，中國傳統肉制品如醬鹵等添加的輔料（如八角、大茴）對C.perfringens生長的影響尚不清楚。

人工神經網絡（artificial neural networks，ANN）是一種以模擬人類或動物神經網絡行為特征，進行分布式并行信息處理的算法數學模型[18]，廣泛應用于非線性建模、函數逼近、建立神經網絡模型等領域。BP神經網絡基于誤差反饋，采用后向傳播算法，是目前應用最為廣泛，最具成效的神經網絡之一。使用BP神經網絡對微生物生長的建模，近年來也有所研究，如侯奇等[19]利用BP神經網絡構建李斯特氏菌的微生物生長模型，易甜等[20]采用神經網絡預測酸奶的貨架期等。本論文擬從常見的香辛料精油中篩選出對 C.perfringens有抑制作用的肉桂精油、艾草精油、茴香精油，通過BP神經網絡構建熟制雞胸肉中C.perfringens生長/殘存動力學模型，為快速進行微生物風險評估提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原材料與精油

熟制雞胸肉：市售，熟制雞胸肉進行15 min水蒸氣滅菌處理，每60 g一份，分裝備用。

肉桂精油，艾草精油，茴香精油，黑胡椒精油和姜精油：購自上海回恩國際貿易有限公司，精油濃度均為0.88 mg/mL。

1.1.2 菌種

產氣莢膜梭菌ATCC13124：購于ATCC菌種庫；

產氣莢膜梭菌C1：真空脹袋的鹽焗雞中分離所得。

1.1.3 試劑與培養基

胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸（TSC）瓊脂、液體硫乙醇酸鹽培養基（FTG），亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂（SPS）培養基，均購自北京陸橋技術股份有限公司；胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）、吐溫-80，均購自北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.1.4 主要儀器

VORTEX-2GENIE渦旋振蕩器（美國ScientificIndustries公司）；PX-1505H-Ⅱ生化培養箱（上海新苗醫療器械公司）；T18 basic高速分散器（德國IKA公司）；AW200SG厭氧工作站（英國ELECTROTEK公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同濃度的香辛料精油的配制

參考李京晶[21]方法，按表 1配置不同質量濃度香辛料精油，均質1 min，制得精油懸浮液。

表1 熟制雞胸肉中的香辛料精油的濃度Table 1 Concentration of spices essential oil in cooked chicken breast meat

1.2.2 培養基的制備

參考 SN/T 1538.1-2016[22]，將 15～20 mL TSA（tryptose soya agar）和 TSC（tryptose sulfite cycloserine）培養基分別倒入培養皿（90 mm）中，待培養基冷卻凝固，即制備好平板，待用；將FTG（fluid thioglycollate medium）液體培養基滅菌后，待用。

1.2.3 細菌培養物的制備

參考王小慧等[23]制備濃度為 108CFU/mL的C.perfringens初始菌液，稀釋至104備用。

1.2.4 細菌的計數

培養后雞胸肉取樣，每組2個平行，取200 μL于TSC平板進行微生物測定（平板涂布法），每梯度做 2個平行，涂布完成，37 ℃厭氧培養18 h，對平行試驗中同一稀釋度的3個平板上C.perfringens進行菌落計數。

1.3 模型構建

用 MATLAB軟件構建 BP神經網絡[24-28]進行C.perfringens生長/殘存模型預測。

1.3.1 數據歸一化和去歸一化處理

在運用BP神經網絡作為某目標值的預測時，為使網絡訓練更加準確，在訓練之前將所有輸入資料進行歸一化處理[23]，是為了避免選擇許多與目標值相關的輸入因子作為輸入值時所造成的巨大差異性，可以根據公式（1）將數據全部壓縮在0～1范圍內。

式中kn為尺度化的值；k為原始資料；Amax和Amin分別為資料庫中的最大值和最小值。

本文將肉桂精油、艾草精油、茴香精油3種天然的香辛料精油的不同質量濃度作為輸入參數；對應的熟制雞胸肉中C.perfringens（C1和ATCC13124）生長/殘存數作為目標參數；通過歸一化將資料數值變為 0到 1范圍內。

文中選 6組試驗樣本進行預測，并對預測結果進行返歸一化處理。

1.3.2 隱層神經元函數的選取和算法優化

采用的是含有一個隱含層的單輸入單輸出的雙層BP網絡作為預測模型。由于目前輸入輸出已確定因此網絡中隱含層神經元的數目決定了實際問題的復雜程度以及對期望誤差，訓練結果采用判定模擬值與預測值兩者之間相關性的決定系數R2、均方根誤差RMSE進行評定。基于文獻中的經驗公式[29]，文中選取得隱層神經元個數通過試驗比較得到數目為2。

該BP神經網絡使用列文伯格-馬夸爾特演算法[30-31]，在程序中可以通過直接設定規則化性能函數及性能比來增進網絡廣義化能力，且如果設定更大，則網絡將會花費比提前停止法較長的時間來進行收斂，經過訓練的樣本歸一化后則其網絡學習參數為trainlm函數，最大的訓練次數為5 000次，訓練步長0.1，期望誤差為1×10-7，創建一個單向傳播的多層前向網絡。

1.4 模型評價

應用建立的不同濃度精油下熟制雞胸肉中C.perfringens生長/殘存動力學模型求得的預測值，與測得的實際值進行對比，采用偏差度（Af）和準確度(Bf)來評價模型的可行性。

方程（2）和（3）中，N實測是試驗實際測得的C.perfringens數量，lgCFU/g；N預測是應用 BP神經網絡模型得到的與N實測同一濃度的 C.perfringens數量，lgCFU/g；n是試驗次數。

1.5 模型驗證

將樣本保存在一個矩陣中，從3個樣本中隨機挑取1個放入預測集，隨機訓練集占總樣本的60.6%（120例），驗證樣本占32.5%（39例），預測樣本占32.5%（39例）。分別采用均方根誤差RMSE（公式4）和相關系數R2（公式（5））來評價模型驗證的精度。

1.6 數據分析

采用2016bMATLAB數據處理與統計分析，所有的數據均為3個平行樣品測定3次的平均值。

2 結果與分析

2.1 BP神經網絡構建不同香辛料精油對 C.perfringens殘生長/殘存預測模型及模型驗證

2.1.1 模型構建

香辛料精油對熟制雞胸肉中 C.perfringens具有抑制作用，在一定濃度范圍內，精油濃度越大，C.perfringens的最終濃度越小；采用 BP神經網絡模型進行非線性擬合，繪制出肉桂精油、艾草精油精油 3種精油對熟制雞胸肉中C.perfringens的預測模型曲線。

圖1為3種香辛料精油對熟制雞胸肉中C.perfringens（ATCC13124和C1）生長/殘存模擬情況，依據BP神經網絡擬合曲線斜率判斷ATCC13124和C1隨濃度下降速率：當精油濃度≤5.5 mg/mL時，ATCC13124隨肉桂精油和茴香精油濃度增加下降的速率大于C1；在相同濃度范圍內，ATCC13124隨艾草精油濃度增加下降的速率低于C1；當精油濃度≥11 mg/mL時，ATCC13124隨肉桂精油和艾草精油濃度增加下降速率低于C1，尤其為肉桂精油曲線幾乎趨于平緩，不再發生變化，在相同濃度范圍內ATCC13124隨茴香精油濃度增加下降速率高于C1；當精油濃度≥22 mg/mL時，ATCC13124和C1隨肉桂精油濃度增加變化，趨勢趨于平緩，ATCC13124隨艾草精油濃度增加下降速率逐漸大于C1，ATCC13124隨茴香精油濃度增加下降速率逐漸減小，C1則相反。對比上述結果發現，同一精油，對不同C.perfringens菌株ATCC13124和C1的抑制情況不同。

BP神經網絡模型預測不同香辛料精油對熟制雞胸肉中C.perfringens ATCC13124和C1殘存情況結果：精油濃度為5.5 mg/mL時，ATCC13124和C1在肉桂精油中殘存數低于 7.00 lgCFU/g而在艾草精油和茴香精油中均大于7.00 lgCFU/g；精油濃度為11 mg/mL時，ATCC13124和C1在肉桂精油中殘存數低于7.00 lgCFU/g而在艾草精油和茴香精油中均大于7.00 lgCFU/g；精油濃度為22 mg/mL時，ATCC13124和C1在肉桂精油中殘存數低于5.00 lgCFU/g，ATCC13124和C1在艾草精油和茴香精油中均大于5.00 lgCFU/g。因此，對比同一濃度，肉桂精油中的C.perfringens殘存數較低，抑制作用比艾草精油和茴香精油明顯。

圖1 BP神經網絡擬合不同香辛料精油對熟制雞胸肉中C.perfringens的預測模型Fig.1 Prediction models of C.perfringens in cooked chicken breast by BP neural network fitting different essential oils

2.1.2 模型評價

由表 2可知在不同精油下準確度（Af)和偏差度(Bf),預測值和實測值之間的差異Af均接近于 1，介于 10%以內，預測值上下波動的幅度Bf的值不超過1%，因此基于BP神經網絡建立的不同香辛料精油對C.perfringens的生長/殘存動力學模型是可靠的。

表2 BP神經網絡擬合不同精油對熟制雞胸肉中C.perfringens（ATCC13124、C1）菌的模型驗證指標Table 2 BP neural network fitting model validation indicators of different essentbial oils for C.perfringens (ATCC13124, C1) in cooked chicken breast

2.2 BP神經網絡構建不同香辛料精油對產氣夾膜梭菌殘生長/殘存預測模型驗證

通過交互驗證的方法對不同香辛料精油的濃度與C.perfringens生長/殘存數建立校正模型，然后通過獨立樣本對模型進行魯棒性檢驗結果如圖2和表3所示：所構建的模型的預測精度R2均大于0.917，擬合度高，其中針對ATCC13124，艾草精油的預測效果均最佳，訓練集、預測集和驗證集R2分別為0.992、0.988、0.986，均方根誤差RMSE分別為0.197、0.197、0.200 CFU/g；對于C1，肉桂精油的預測模型效果最佳，訓練集、預測集和驗證集 R2分別為 0.976、0.971和 0.970，均方根誤差 RMSE分別為0.271、0.272、0.279 CFU/g。

圖2 BP神經網絡擬合不同香辛料精油對熟制雞胸肉中C.perfringens的模型驗證Fig.2 Model verification of C. perfringens in cooked chicken breast by BP neural network fitting different spices essential oils

表3 BP神經網絡擬合添加精油時熟制雞胸肉中C.perfringens（ATCC13124、C1）的模型驗證評價指標Table 3 BP neural network fitting model verification evaluation index of parameter resetting of C.perfringens (ATCC13124, C1) in cooked chicken breast meat when adding essential oil CFU·g-1

3 結 論

本研究應用 BP神經網絡模型擬合不同香辛料精油對熟制雞胸肉中C.perfringens的生長/殘存曲線，R2均在0.922～0.992之間；對模型進行魯棒性檢驗結果發現 R2均在0.920以上，均方根誤差RMSE在0.200～0.640 CFU/g之間，預測值和實測值擬合效果較好。表明BP神經網絡模型對熟制雞胸肉中C.perfringens生長/殘存情況有很好的預測效果；依據BP神經網絡擬合C.perfringens的生長/殘存生長率，同一精油，對不同 C.perfringens菌株ATCC13124和C1的抑制情況不同，顯示出差異性；對比同一濃度，發現肉桂精油中C.perfringens殘存數最低，抑制作用最強。