ANO1蛋白在胃腺癌組織中表達及臨床意義

白璐 王濤 張喆

[摘要]目的 分析胃腺癌及正常胃黏膜組織切片中Anoamin1（ANO1）蛋白的表達情況，探討ANO1蛋白在胃腺癌發生發展中的作用。方法 應用免疫組織化學方法檢測2016年1月～2018年6月中國醫科大學附屬盛京醫院78例胃腺癌、沈陽金域醫學檢驗所21例正常胃黏膜組織中ANO1蛋白的表達情況。分析對比ANO1蛋白在胃腺癌及正常胃黏膜組織中的表達差異，研究ANO1蛋白與胃腺癌患者臨床病理指標之間的相關性。結果 胃腺癌組織中ANO1蛋白表達陽性率為43.59%（34/78），高于正常胃黏膜組織的14.29%（3/21），差異有統計學意義（χ2=6.070，P=0.014）。不同年齡、性別、腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結轉移及長期飲酒情況下的ANO1蛋白表達陽性率比較，差異無統計學意義（P>0.05）；不同分化程度及HER2情況下的ANO1蛋白表達陽性率比較，差異有統計學意義（P<0.05）。患者胃腺癌ANO1蛋白表達與年齡、性別、腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結轉移情況及長期飲酒情況無關（P>0.05），與腫瘤分化程度、HER2均成負相關（r=-0.276、-0.315，P=0.015、0.005）。結論 ANO1蛋白在胃腺癌中的表達升高，ANO1蛋白陽性更多出現在腫瘤分化程度低、HER2蛋白陰性的患者中，ANO1蛋白在胃腺癌發生發展中發揮重要作用。

[關鍵詞]ANO1；胃腺癌；HER2

[中圖分類號] R73-3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2019）5（b）-0008-04

[Abstract] Objective To analyze the expression of Anoamin1 （ANO1） protein in gastric adenocarcinoma and normal gastric mucosal tissue sections and to explore the role of ANO1 protein in the development of gastric adenocarcinoma. Methods Immunohistochemical method was used to detect the expression of ANO1 protein in 78 cases of gastric adenocarcinoma from Shengjing Hospital of China Medical University and the expression of ANO1 protein in 21 cases of normal gastric mucosa tissues from Shenyang Jinyu Medical Laboratory from January 2016 to February 2018. The difference in the expression of ANO1 protein in gastric adenocarcinoma and normal gastric mucosa was analyzed and compared， and the correlation between ANO1 protein and clinicopathological parameters of gastric adenocarcinoma patients was studied. Results The positive rate of ANO1 protein expression in gastric adenocarcinoma tissues was 43.59% （34/78）， which was higher than that in normal gastric mucosa tissues accounting for 14.29% （3/21）， and the difference was statistically significant （χ2=6.070， P=0.014）. There was no significant difference in the positive rate of ANO1 protein expression in different ages， genders， tumor diameters， depth of invasion， lymph node metastasis and long-term drinking （P>0.05）. The positive rate of ANO1 protein expression in different degrees of differentiation and HER2 was statistically significant （P<0.05）. The expression of ANO1 protein in gastric adenocarcinoma was not associated with age， gender， tumor diameter， depth of invasion， lymph node metastasis and long-term drinking status （P>0.05）. ANO1 protein expression was negatively correlated with tumor differentiation and HER2 （r=-0.276， -0.315； P=0.015， 0.005）. Conclusion The expression of ANO1 protein in gastric adenocarcinoma increases， and ANO1 protein positivity is more common in patients with low tumor differentiation and HER2 protein negative. ANO1 protein plays an important role in the development of gastric adenocarcinoma.

[Key words] ANO1； Gastric adenocarcinoma； HER2

胃癌是一種具有高侵襲性和致命性的惡性腫瘤，占全球新發癌癥病例的8.6%，是癌癥相關死亡的第二大原因[1]，其惡性程度高，多數患者死于腫瘤的復發和遠處轉移。因此明確與胃腺癌發生及轉移的分子機制有重要臨床指導意義。Anoamin1（ANO1）蛋白又稱為跨膜蛋白16A，是鈣離子激活氯離子通道蛋白家族成員之一[2]。研究表明ANO1多種惡性腫瘤中過表達且與患者的不良預后相關[3]。但ANO1蛋白在胃癌組織中的表達及臨床意義的報道少見。本研究擬采用免疫組織化學染色方法，檢測胃腺癌及正常黏膜組織中ANO1的表達，初步探索ANO1蛋白在胃腺癌發生發展中的潛在機制及臨床意義，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年1月～2018年6月中國醫科大學附屬盛京醫院胃癌手術患者78例，以沈陽金域醫學檢驗所電子內窺鏡活檢慢性胃炎樣本21例正常胃黏膜進行對照。患者年齡32～82歲，中位年齡64歲。78例胃癌患者均經病理組織學證實診斷為胃腺癌，其中高分化胃腺癌16例，中分化胃腺癌34例，低分化胃腺癌28例。患者飲酒情況以患者住院病歷為準。本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2免疫組織化學染色

胃腺癌組織及正常胃黏膜蠟塊3 μm切片，采用二甲苯脫蠟，pH=6檸檬酸的檸檬酸修復抗原，3%去離子水封閉內源性過氧化氫酶，ANO1一抗（美國Santa Cruz公司，產品序列sc-377115）1∶200倍稀釋在恒溫冰箱孵育過夜，二抗為山羊抗兔/鼠聚合物（北京中杉金橋生物技術有限公司，產品序號PV-6000），DAB顯色劑及蘇木素染色均按照說明書進行。

1.3觀察指標及評價標準

比較胃腺癌及正常胃黏膜組織中ANO1蛋白的表達情況，分析胃腺癌患者不同年齡、性別、腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結轉移、分化程度低、HER2及長期飲酒情況下的ANO1蛋白表達陽性率。

ANO1蛋白陽性表達信號主要位于細胞膜/質，參照文獻[4]判定標準，蛋白表達水平采用染色細胞面積及染色強度評分綜合判斷，染色面積與染色強度評分乘積≥4分計為陽性，其中按照染色面積分<5%、5%～25%、>25%～50%、>50%分別為1、2、3、4分；按照染色強度分無陽性、淺黃色、深黃色、褐黃色分別為0、1、2、3分。

1.4統計學方法

采用SPSS 23.0統計學軟件進行數據分析，計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性研究采用Spearman分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1胃腺癌及正常胃黏膜組織中ANO1蛋白的表達情況

ANO1蛋白免疫組織化學染色定位于細胞膜，陽性細胞膜染色呈黃褐色（圖1，見封四）。78例胃腺癌患者組織中，34例ANO1蛋白陽性，陽性率為43.59%（34/78），高于正常胃黏膜組織的14.29%（3/21），差異有統計學意義（χ2=6.070，P=0.014）。

2.2 ANO1蛋白在胃腺癌組織中的表達情況

不同年齡、性別、腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結轉移及長期飲酒情況下的ANO1蛋白表達陽性率比較，差異無統計學意義（P>0.05）；不同分化程度及HER2情況下的ANO1蛋白表達陽性率比較，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

2.3胃腺癌ANO1蛋白表達與臨床病理指標的相關性分析

患者胃腺癌ANO1蛋白表達與年齡、性別、腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結轉移情況及長期飲酒情況無關（P>0.05），與腫瘤分化程度、HER2均成負相關（r=-0.276、-0.315，P=0.015、0.005）（表2）。

3討論

胃腺癌是當今世界上最常見的惡性腫瘤中之一，在我國消化道的惡性腫瘤中居第2位[1]。目前對于胃癌治療首選手術治療，術后輔助放療、化療等惡性腫瘤綜合治療，但由于腫瘤被發現時經常已經出現了腫瘤的轉移，療效并不滿意，因此探索腫瘤的發病機制，早期發現早期治療格外重要[5]。鈣激活的氯離子通道（CaCCss）分布在平滑肌細胞、心肌細胞、神經細胞等興奮細胞及上皮細胞等非興奮細胞，具有廣泛的生理作用。鈣激活的氯離子通道蛋白A（TMEM16A）家族是CaCCss的分子基礎，TMEM16A也因為含有陰離子通道（Anion）又稱為ANO1[6]。研究表明ANO1在神經細胞痛覺傳導[7]、唾腺體分泌[8]、Cajal胃腸間質細胞正常慢波的形成[9]等多種生理過程中起重要作用。

近年來ANO1在腫瘤發生發展中的作用成為研究的熱點，ANO1基因定位于人類染色體11q13，該區域在多種腫瘤中發生擴增[10]，ANO1蛋白在多種腫瘤中被檢測到出現過表達。在頭頸部鱗癌[11]及食管鱗狀細胞癌[12]中ANO1出現過表達，并且是不良的預后的生物標志物。Song等[13]研究者在前列腺癌中發現敲低ANO1后腫瘤壞死因子-α（TNF-α）信號增強，進而導致磷酸化的Fas相關蛋白上調從而誘導前列腺細胞凋亡。在乳腺癌中抑制ANO1顯著抑制細胞的增殖[14]，另外在膠質母細胞瘤[15]中的研究中ANO1也被證實具有促癌作用。本研究中，ANO1在胃腺癌組織中表達率顯著高于正常胃黏膜（P<0.05），臨床病理資料分析顯示，分化程度越低的胃腺癌ANO1蛋白表達越高，筆者推測在胃腺癌中過表達的ANO1具有促進腫瘤細胞增殖的作用，與相關學者們在其他腫瘤中的研究結論類似。

由于ANO1在腫瘤組織的過表達被廣泛證實，有效的和選擇性的ANO1抑制劑可以為癌癥治療提供新的策略。遺傳藥理學研究表明抑制ANO1可以誘導細胞凋亡和促進細胞周期停滯于G1期[16]。HER2基因在乳腺癌、胃腺癌等多種惡性腫瘤中過表達，在胃腺癌中HER2蛋白陽性表達差異較大[17]，HER2擴增的胃腺癌患者應用曲妥珠單抗可以提高總緩解率、煙草患者存活時間[18]。在乳腺癌的研究中發現，ANO1與HER2成負相關，對靶向HER2的單克隆抗體曲妥珠單抗耐藥的細胞表現出ANO1表達增加[19]。ANO1可能作為HER2的轉錄調節因子，ANO1抑制劑可以改善患者對HER2靶向治療的敏感性甚至逆轉耐藥[20]。本研究結果提示，胃腺癌患者中的ANO1蛋白與HER2成顯著的負相關（P<0.05），因此筆者推測在胃腺癌患者化療藥物應用上尤其是HER2陰性或曲妥珠單抗耐藥中檢測ANO1蛋白的表達，必要時使用ANO1的特異性抑制劑輔助治療可能對改善患者預后有益。但對于ANO1和HER2在胃癌中的具體作用機制尚不夠明確，仍需通過進一步的體內外實驗來闡明具體的分子作用機制。

綜上所述，本研究在胃腺癌組織中證實ANO1的異常表達與胃癌的發生關系密切，因此病理診斷時檢測ANO1蛋白可能對疾病診斷有益。ANO1與腫瘤分化程度、HER2蛋白成負相關，HER2蛋白陰性患者中ANO1蛋白陽性更常見，ANO1可能是胃癌治療中的新型預后生物標志物和潛在的治療靶標。

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（收稿日期：2018-12-04 本文編輯：任秀蘭）