干細胞轉錄因子Sox2和Nanog在非小細胞肺癌中的表達及意義

王永芳 宋姍姍 張春芳 陳昊

徐州醫科大學附屬連云港市第一人民醫院（江蘇連云港222002）

肺癌在我國發病率呈持續上升趨勢，其病死率在全球范圍內已躍居惡性腫瘤之首，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌總數的75% ～80%，腺癌和鱗癌是其最常見的病理亞型，盡管近幾十年來NSCLC 的診斷和臨床治療取得了突破性進展，但NSCLC 患者5年總生存率僅約為15%，復發率仍居高不下［1-2］。近年來，腫瘤干細胞理論的提出為肺癌研究開辟了新方向，針對腫瘤干細胞的治療策略有望成為治療肺癌的有效手段之一［3］。Sox2 和Nanog 是維持成人和胚胎干細胞自我更新及多向分化潛能必不可少的轉錄因子，共同位于細胞多能性調控網絡的核心位置，調節多能相關基因的表達［4-5］。多項研究［6-10］顯示Sox2 和Nanog 在多種腫瘤組織中表達失調，其異常表達與腫瘤細胞的發生發展密切相關。但同時研究兩者在NSCLC 中表達的相關性報道較少，本實驗采用免疫組化技術聯合檢測Sox2 和Nanog 蛋 白 在NSCLC 的表達情況，并 分析它們與臨床病理參數之間的關系，探討兩者在NSCLC 發生發展過程中起到的作用，為尋求潛在治療靶點提供實驗基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年6月至2017年6月在連云港市第一人民醫院手術切除的120 例NSCLC標本作為觀察組，年齡30～76 歲，中位年齡61 歲；男90 例，女30 例，經兩位高年資病理醫師依據2015年WHO 肺癌分類及診斷標準復核切片（鱗癌和腺癌各60 例）。腫塊直徑1.5 ～11 cm，中位直徑3.5 cm；臨床TNM 分期：Ⅰ期44 例、Ⅱ期36 例、Ⅲ期32 例、Ⅳ期8 例；有淋巴結轉移46 例，無淋巴結轉移74 例。所有患者均為首次發病且術前未進行化療、放療及免疫治療，同時選取其中30 例患者癌旁組織（距癌組織≤3 cm）及正常肺組織（距癌組織＞3 cm）作為對照組。本研究獲得連云港市第一人民醫院倫理委員會批準，樣本提供者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 兔抗人Sox2 單克隆抗體（即用型）購自廣州安必平生物科技有限公司，兔抗人Nanog 單克隆抗體（濃縮液）購自Cell Signaling Technology 公司，以1∶400 倍稀釋?？乖迯鸵骸⑦^氧化物酶阻斷劑、二抗、DAB 顯色液、PBS 均購自美國DAKO 公司。

1.3 免疫組化 標本均用4%中性甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，4 μm 厚連續切片，HE 染色，光鏡下觀察。免疫組化采用EnVision 二步法，應用儀器Roche BENCH MARK XT 免疫組化染色儀行免疫組化染色。操作流程嚴格參照試劑說明書要求，同時用PBS 代替一抗做陰性對照，已知陽性的NSCLC 組織作陽性對照。

1.4 結果判定 采用經典半定量積分法［11］：陽性細胞所占比例和著色強度兩因素綜合評分方法。選取染色均勻的陽性腫瘤區域，每張切片選取5 個高倍鏡（× 200）視野，分別計算其陽性細胞所占比例和著色強度。（1）按陽性細胞所占比例計分：陽性細胞數＜6%計0 分，6%～25%計1 分，26%～50%計2 分，51%～75%計3 分，＞75%計4 分；（2）按著色強度計分：標本無著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。將兩項得分結果相乘：0 分為（-），1～4 分為（+），5～7 分為（2+），8 分以上為（3+），—為陰性，+為弱陽性，2+為中陽性，3+為強陽性。

1.5 統計學方法 Excel 收集數據，運用SPSS 16.0軟件對數據進行統計學分析，表達強度比較采用多組獨立樣本秩和檢驗，組間比較采用χ2檢驗，兩種蛋白之間的相關性采用2×2 配對資料的關聯性分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Sox2 和Nanog 在NSCLC、癌旁及正常肺組織中的表達情況 Sox2 在NSCLC 組織中細胞核著色，以棕黃色顆粒為主，陽性表達率為59.2%（71/120）；在癌旁組織中陽性表達率為13.3%（4/30），以淡黃色顆粒為主；在正常肺組織中陽性表達率為6.7%（2/30）；NSCLC 組織中Sox2 表達顯著高于癌旁組織及正常肺組織（均P＜0.01）。見圖1、表1。

圖1 Sox2 在肺鱗癌和腺癌中表達（EnVision 法，×200）Fig.1 The expression of Sox2 in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma

Nanog 在NSCLC 組織中細胞核著色，以棕黃色顆粒為主，同時伴有細胞漿著色，Nanog 陽性表達率為48.3%（58/120）；在癌旁組織中陽性表達率為6.7%（2/30），以淡黃色顆粒為主；在正常肺組織中未見陽性表達，三者比較差異有統計學意義（均P＜0.01）。見圖2、表1。

表1 Sox2 和Nanog 在不同病變肺組織中的表達Tab.1 Nanog and Sox2 were expressed in different lung tissues of different lesions例（%）

圖2 Nanog 在肺鱗癌和腺癌中表達（EnVision 法，×200）Fig.2 The expression of Nanog in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma

2.2 Sox2、Nanog 表達與NSCLC 的臨床病理特征關系 Sox2 在肺鱗癌中陽性率為81.7%，在肺腺癌中陽性率為36.7%，差異有統計學意義（P＜0.01）；Nanog 在肺鱗癌中陽性率為58.3%，在肺腺癌中陽性率為38.3%，差異有統計學意義（P＜0.05，表2）。NSCLC 中Sox2 的表達水平與腫瘤大小有關，隨著腫瘤體積增大，Sox2 蛋白表達上調（表2）；Nanog的表達水平與腫瘤大小、淋巴結轉移及臨床分期有關，其中Nanog 的表達水平與腫瘤大小呈正相關，臨床分期Ⅲ＋Ⅳ者高于Ⅰ＋Ⅱ者，淋巴結轉移者高于無轉移者（P＜0.05），但兩者陽性表達與年齡和性別均無相關性（表2）。

表2 Sox2 和Nanog 蛋白表達與NSCLC 臨床病理的關系Tab.2 The correlation between expression of Nanog and Sox2 and clinicopathological characteristics of NSCLC 例（%）

2.3 NSCLC組織中Sox2和Nanog表達的相關性在120 例NSCLC 組織中Sox2 與Nanog 均陽性 者41例（34.2%），均陰性者32 例（26.7%），Sox2 陽性而Nanog 陰性者30 例（25.0%），Nanog 陽性而Sox2 陰性者17 例（14.1%）。2×2 配對資料的關聯性分析顯示，在NSCLC 中Sox2 與Nanog 表達呈正相關（r=0.227，P＜0.05）。見表3。

3 討論

Sox2 基因是Sox 家族的重要成員之一，位于染色體3q26.3-q27 上，通過與靶基因的HMG 結構域特異性結合，從而維持胚胎干細胞自我更新及分化潛能，且在重新程序化體細胞使之成為多能干細胞過程中發揮重要的作用。胚胎期間的Sox2 保持沉默，而在機體發育過程中，Sox2 被激活參與細胞分裂分化［12］。對肺臟的發育來說，Sox2 是一種重要的基因，多項研究［7，13］均顯示Sox2 在肺、食道及頭頸鱗癌中過表達。

表3 NSCLC 組織中Sox2 和Nanog 表達的相關性分析Tab.3 Expression correlation between Nanog and Sox2 in lung NSCLC tissues 例

專家組通過對178 例肺鱗癌基因圖譜測序數據表明Sox2 是與肺癌相關的癌基因，在肺鱗癌的發生發展中具有極其重要的作用［14］。為進一步探討Sox2 蛋白表達與NSCLC 之間關系，本研究對120 例手術切除標本采用免疫組化檢測，結果顯示NSCLC、癌旁組織及正常肺組織中Sox2 陽性表達率呈降低趨勢，在NSCLC 中的表達率顯著高于癌旁組織和正常肺組織（均P＜0.01），此外，Sox2 表達與病理類型密切相關，在鱗癌中的表達顯著高于腺癌（81.7%vs.36.7%，P＜0.01）。這些研究結果與其他學者結論一致，YING 等［11］發現Sox2 在NSCLC 組織中高表達，其表達率為35.4%，顯著高于癌旁組織，Sox2 陽性表達率在肺鱗癌為50.0%，肺腺癌中為20.3%。癌癥基因組圖譜專家的研究揭示，Sox2 基因所在染色體3q26 區域在包括肺鱗癌在內的多種鱗癌中普遍擴增，提示Sox2 基因拷貝數增加可能參與肺鱗癌的惡性進展［14］。SASAKI 等［15］對127 例手術切除的肺非小細胞癌標本研究發現，Sox2 蛋白表達在鱗癌為85.4%，腺癌為45.5%，基因拷貝數增加在鱗癌中為15.4%，而在腺癌中則為3.8%，他們認為Sox2 基因拷貝數增加是引起其在肺鱗癌過表達的常見原因之一，而肺腺癌中Sox2 過表達可能是由轉錄水平或轉錄后修飾等其他機制引起。BASS 等［13］對肺和食管鱗癌的研究也表明Sox2 可能與鱗癌鱗狀上皮分化有關，它可以誘導鱗癌相關因子p63 和角蛋白6A 的表達并促進癌細胞的增殖。

本實驗結果還顯示Sox2 陽性表達與腫瘤大小正相關，究其原因較為復雜，CHOU 等［16］的研究認為Sox2 可誘導激活EGFR 和BCL2L1 信號傳導通路，形成Sox2-EGFR 反饋環進而促進肺癌細胞生長和增殖，這可能是其促進腫瘤體積增大的原因之一。RUAN等［17］在膀胱癌中研究也發現Sox2表達與腫瘤大小、腫瘤數量和腫瘤分級有關。有研究［18］表明Sox2 在NSCLC 中的高表達可以促進NSCLC 患者淋巴結轉移和較晚的臨床分期，可能在NSCLC的浸潤及轉移過程中起重要作用，Sox2 高表達的腫瘤惡性程度更高，預示患者較差的預后，推測其可作為NSCLC 獨立的預后因素。本研究中Sox2 陽性表達與淋巴結轉移和臨床分期未見相關性，可能與本研究收集病例中晚期腫瘤組織標本較少有關，故仍需更大樣本量多層次的深入研究。

Nanog 是又一重要的干細胞轉錄因子，和Sox2一起在早期胚胎發育過程中對維持人體胚胎干細胞多向分化潛能及決定細胞分化命運有重要作用，兩者主要通過形成調控環路、激活其靶基因并與其他信號通路協同作用來維持干細胞全能性和自我更新能力。研究表明Nanog 在肺癌球細胞和乳癌CD44+細胞等腫瘤干細胞中表達升高，減少Nanog 的表達可以有效降低腫瘤干細胞比例［19］。

本實驗結果顯示，Nanog 蛋白在NSCLC 中的陽性表達率為48.3%，顯著高于癌旁組織（6.7%），而在正常肺組織中未見陽性表達；本研究還發現Nanog 蛋白的表達與NSCLC 患者某些臨床病理特征存在相關性，Nanog 蛋白的陽性表達率與腫瘤體積正相關，淋巴結轉移組高于無轉移組，臨床TNM分期Ⅲ＋Ⅳ者組高于Ⅰ＋Ⅱ者，表明Nanog 可能參與了NSCLC 的增殖、侵襲及轉移等多個過程。在其他腫瘤組織中也有相似的發現，LIU 等［20］發現卵巢癌患者組織中Nanog 在基因和蛋白水平均過表達，與腫瘤低分化顯著相關，敲除Nanog 基因后可以抑制卵巢癌細胞增殖、侵襲和遷移。NAGATA等［21］對乳腺癌患者的研究也發現，與Nanog 表達較弱的患者相比，Nanog 強表達的患者的無病生存率和總生存率顯著降低，Nanog 的強表達是乳腺癌患者預后不良的指標，Nanog 可刺激乳腺癌細胞的生長和轉移。CHANG 等［22］對112 個肺癌大樣本的多變量分析結果顯示，Nanog 的表達與年齡、吸煙狀況和分期等臨床參數無相關性，但Nanog 高表達的患者無進展生存期和總生存期縮短。然而也有研究［23］發現Nanog 蛋白可能在肺癌的起始階段發揮著重要作用，其研究結果顯示Nanog 在肺癌中的表達在無淋巴結轉移組中的表達高于有淋巴結轉移者，而與腫瘤大小未見相關性，但其研究結果也同樣表明Nanog 在肺癌中的表達顯著高于良性病變和正常肺組織，說明Nanog 參與了肺癌的發生發展。但不同學者的關于Nanog 與臨床病理參數關系的結論不盡相同，也進一步表明Nanog 對肺癌的作用可能存在極其復雜的調控機制，受到微環境和其他多種因子共同調控，需要更多樣本量、更深層次和更廣泛腫瘤類型的深入研究。MA 等［24］新近提出了一種基于反dsDNA 抗體修飾的Fe304 磁鐵礦納米粒子的多色檢測方法，可以更加靈敏同時有針對性的快速檢測癌癥干細胞中Sox2、Oct4 和Nanog，該方法可以產生定量結果，可分析轉錄因子結合位點的多態性，為系統深入研究Nanog 干細胞轉錄因子提供了高效的研究平臺。此外，本研究還顯示Nanog 蛋白的表達與NSCLC的組織類型相關，Nanog 蛋白在肺鱗癌和腺癌中均有表達，但其在鱗癌中的陽性表達率較肺腺癌明顯升高（P＜0.05）。本實驗結果相關分析顯示，NSCLC 組織中Sox2 蛋白表達與Nanog 蛋白表達呈正相關，提示Sox2 和Nanog 在NSCLC 的發生發展中可能發揮協同作用。

綜上所述，Sox2 和Nanog 在NSCLC 中的表達明顯高于癌旁組織，并且兩者呈正相關，說明兩者共同參與了NSCLC 的發生和進展過程。此外，Sox2 和Nanog 的表達水平腫瘤大小及病理類型有關，在肺鱗癌中表達均顯著高于肺腺癌，Nanog 表達水平與腫瘤大小、淋巴結轉移及臨床分期密切相關，兩者相互協同在NSCLC 增殖轉移及侵襲中發揮重要作用，有望作為評估NSCLC 進展和生物學行為的重要指標，靶向Sox2 和Nanog 可能是潛在、高效的治療NSCLC 方法。這些研究結果為臨床工作中NSCLC 診斷和評估進展提供了新的思路，但具體機制和應用價值還有待進一步深入研究。